[发明专利]农杆菌介导木本植物叶芽原位基因转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物基因转化方法，特别是一种利用农杆菌介导、不需要组织培养过程的基因转化新方法。

技术背景

杨树是重要的绿化及工业用材树种，杨树基因组测序的完成，使其成为最重要的研究林木生物学的模式植物，其遗传转化在国内外都非常受重视。目前已用农杆菌介导法获得了一系列转基因杨树品种，但所采用的方法都是常规的农杆菌介导法，需要通过耗时耗力的植物组织培养过程。在专利号为01104185.4的中国专利中公开了一种利用农杆菌直接转化玉米萌发种胚的转基因方法，该发明是一种利用农杆菌介导植物萌发种子进行基因转化的方法，即以植物萌发种子为受体材料，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因供体，在植物种子萌发过程中与农杆菌共培养，使其将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。种子是植物体的雏形，而叶芽是枝条的雏型，既然农杆菌可通过直接侵染种胚导入外源基因，就有可能利用农杆菌侵染植物叶芽，使其Ti质粒上的T-DNA转移并整合到生长点细胞中，实现对新生枝条的转化，进而通过无性繁殖在短期内即可获得转基因植株。发明内容

本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种以植物萌动叶芽作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生的农杆菌介导木本植物叶芽原位基因转化方法。

本发明的具体技术方案是：以木本植物单叶芽为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在芽刚萌动时划伤生长点，并对划伤部位进行农杆菌侵染及保湿处理，将外源基因转移到受体基因组中，通过抗生素筛选、PCR扩增及Southern杂交，筛选阳性枝条，然后对阳性枝条进行扦插繁殖。由于无性繁殖可使导入基因稳定遗传，因此可在较短时间内得到转基因植株。

本发明所述的木本植物叶芽主要是杨树叶芽。选刚萌动的杨树顶芽和侧芽，在叶芽表面光滑，尚无绿叶出现时进行处理。农杆菌转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内，细胞具有分裂能力是转化的基本条件，刚刚萌动叶芽的生长点细胞处于旺盛分裂期，因此选萌动叶芽为处理受体。

对刚萌动的叶芽用锋利的刀片纵向划伤生长锥。芽是由包括有生长点(茎的顶端分生组织)的生长锥及其叶原基、腋芽原基和幼叶等外围附属物所组成。有些植物的芽在幼叶的外面还包有鳞片茎的原始体，如杨树芽即为鳞芽。为使农杆菌Ti质粒进入到受体细胞中，用刀片纵切植物叶芽使其生长锥部位受伤，由于受伤后的生长点分裂能力下降甚至死亡，而未受伤或处理过轻的生长点则不会被农杆菌侵染，因此划伤应适度。

将携带外源基因片段的农杆菌在叶芽处理的前一天进行培养，从平板上挑取单菌落于加有卡那霉素(50mg/ml)的YP(yeast peptone)液体培养基中进行振荡培养，调节农杆菌溶液0D值至0.1-1.0，将其滴到幼芽伤口处，然后用封口膜包裹被处理的叶芽保湿，2-3天后去膜。

许多双子叶植物是农杆菌的天然宿主。根据前人的研究结果，那些易被农杆菌转化的双子叶植物通常可在感染处分泌出一种酚类物质——乙酰丁香酮，该物质可激活农杆菌Ti质粒上的Vir基因，从而促进农杆菌侵染和对受体的转化。因此当受体为农杆菌宿主植物叶芽时，可直接被农杆菌侵染和转化；当受体为非农杆菌宿主或单子叶植物叶芽时，可在农杆菌悬浮液中加入一定量的乙酰丁香酮作为农杆菌侵染诱导物。本发明方法可用于任何单叶芽木本植物的基因转化。

实验证实：采用农杆菌介导植物叶芽原位基因转化后，外源基因已整合到受体植物染色体中。利用植物叶芽作为农杆菌介导外源基因转化的受体系统，避开了传统农杆菌共培养法所要求的严格繁冗的组织培养过程，缩短了实验周期，且充分利用了母体植株的生长潜力。本发明不需要昂贵的仪器及复杂的操作技术，利用植物叶芽作为受体，操作简单，普通育种工作者就可操作，且一次可处理大量叶芽。本发明对再生困难的木本植物具有较大的意义，特别对于可扦插繁殖的木本植物可以在短期内得到转基因植株，且可稳定遗传，避免了传统的林木育种所面临的周期长、再生难的缺陷。本发明基因转化方法已在杨树上进行了遗传转化并获得了成功，本发明为木本植物、特别是杨树的基因转化提供了一条简便、快速、经济的途径。

附图说明

图1为携带几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因的重组质粒pBI101的物理图谱。卡那霉素基因能赋予植物对卡那霉素的抗性。

图2为几丁质酶基因PCR扩增产物部分电泳图。M为分子量标记DL2000，1为阳性质粒，2为阴性对照，3-11为不同转化枝，其中8、9为阴性枝，其余为阳性枝。