[发明专利]在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法。

背景技术

近年来以植物作为生物反应器瞬时表达外源蛋白以其周期短、易操作和低成本等优点成为一个研究热点。到目前为止利用植物瞬时表达体系的主要方法有叶片直接涂抹法、叶片真空侵染法和叶片注射法三种。其中直接涂抹法和叶片注射法需要逐个叶片操作耗时比较长；叶片真空侵染法主要是在离体叶片上进行，外源蛋白的表达只能限定在被侵染的叶片上，而且真空侵染后需要后续的工作来维持叶片的新鲜度。

作为生物反应器瞬时表达体系的植物有很多种，包括烟草、西红柿、黄瓜、水稻和生菜等。其中以茄科植物作为生物反应器的研究居多，但茄科植物体中含有烟碱，在后期蛋白纯化过程中可能污染目的蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一个方便、快捷可以在豌豆中大量瞬时表达外源蛋白方法。

本发明的具体方案如下：

1.以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬时表达体系。

首先将豌豆早褐病毒载体pCAPE1和pCAPE2-GFP转入农杆菌GV3101中，挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用无菌水溶液重悬，将GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1两种菌体的重悬液混合后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子，侵染后将种子播种于土壤中，8-20天在紫外灯下观察豌豆植株中绿色荧光蛋白的表达情况以确定侵染条件。选择适当的真空压力、真空时间、菌液浓度和伤害处理四个因子进行体系的优化，在无伤害处理条件下，重悬液浓度OD₆₀₀＝1.0-1.2，真空压力为0.06-0.1MPa，真空时间为1-15分钟，于侵染后12-14天收获外源蛋白。

2.以发芽种子真空侵染法在豌豆中瞬时表达人源酸性成纤维细胞生长因子

将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列连入豌豆早褐病毒表达载体pCAPE2中构建得到pCAPE2-aFGF，将其转入农杆菌GV3101中，挑取经鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPE1单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用无菌水溶液重悬，将GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPE1两种菌体的重悬液混合后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子，在无伤害处理条件下，侵染时重悬液浓度OD₆₀₀＝1.0-1.2，真空压力为0.06-0.1MPa，真空时间为1-15分钟，侵染后将种子播种于土壤中，并以1中以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬时表达体系为参照依据，于侵染后12-14天收获外源蛋白。并以Western blot检测外源蛋白人源酸性成纤维细胞生长因子。

豆科植物是非常重要的经济作物，多数的豆科植物蛋白质含量比较高，而且很多豆科植物都是非常优质的牧草，因此以豆科植物作为生物反应器具有重要意义。本发明周期短、易操作、成本低、无污染，可以方便、快捷在豌豆中大量瞬时表达外源蛋白。

具体实施方案

本发明的实施例包括以下内容：

1.以绿色荧光蛋白GFP为报告基因构建并优化豌豆发芽种子真空瞬时表达外源蛋白体系