[发明专利]在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法

权利要求书

1、在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法，其特征是：

1).以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬时表达体系

首先将豌豆早褐病毒载体pCAPE1和pCAPE2-GFP转入农杆菌GV3101中，挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用无菌水溶液重悬；将GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1两种菌体的重悬液混合后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子；侵染后将种子播种于土壤中，8-20天在紫外灯下观察豌豆植株中绿色荧光蛋白的表达情况以确定侵染条件，选择适当的真空压力、真空时间、菌液浓度和伤害处理四个因子进行体系的优化，在无伤害处理条件下，重悬液浓度OD₆₀₀＝1.0-1.2，真空压力为0.06-0.1MPa，真空时间为1-15分钟，于侵染后12-14天收获外源蛋白；

2).以发芽种子真空侵染法在豌豆中瞬时表达人源酸性成纤维细胞生长因子

将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列连入豌豆早褐病毒表达载体pCAPE2中构建得到pCAPE2-aFGF，将其转入农杆菌GV3101中，挑取经鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPE1单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用无菌水溶液重悬；将GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPE1两种菌体的重悬液混合后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子，在无伤害处理条件下，侵染时重悬液浓度OD₆₀₀＝1.0-1.2，真空压力为0.06-0.1MPa，真空时间为1-15分钟；侵染后将种子播种于土壤中，并以1)中以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬时表达体系为参照依据，于侵染后12-14天收获外源蛋白，并以Western blot检测外源蛋白人源酸性成纤维细胞生长因子。

2、按照权利要求1所述的在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法，其特征是：

1).以绿色荧光蛋白GFP为报告基因构建并优化豌豆发芽种子真空瞬时表达外源蛋白体系

将豌豆种子在清水中浸泡6-8小时，之后置于湿润的滤纸上于25-28℃黑暗条件下进行催芽，以根长为2-3厘米的豌豆种子为实验材料进行真空侵染；挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1单菌落，分别接种于5ml含有50mg/L卡那霉素，12.5mg/L四环素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃过夜培养；次日，按照1:50的比例将1ml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，选择OD₆₀₀值范围在1.0-1.2的菌液于常温下4000rpm，10分钟离心收集菌体，菌体沉淀用含有终浓度100μM乙酰丁香酮、10mM NaCl、1.75mM CaCl₂，、250μl Tween20、pH5.6的无菌水溶液重悬；将GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1两种菌体的重悬液1∶1混合，于室温放置90分钟后侵染豌豆发芽种子；将侵染后的种子播种于土壤中，8-20天后在紫外灯下观察GFP的表达情况；设置侵染条件为无伤害处理，菌液浓度OD₆₀₀＝1.0-1.2，真空压力为0.08MPa，真空时间为1分钟；侵染后12-14天绿色荧光蛋白表达量最大，为外源蛋白收获的最佳时间；

2).以发芽种子真空侵染法在豌豆植株中表达人源酸性成纤维细胞生长因子

对pCAPE2载体进行改造，通过PCR方法在原载体上引入BglII酶切位点，根据haFGF序列设计引物，正义引物5’-GGAAGATCTACATGGCTAATTACAAGAAGCC-3’反义引物5’-CGGAATTCTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3’，.经PCR扩增出的aFGF片段，PCR参数：94℃ 3min；94℃ 35sec，54℃ 30sec，72℃ 1min共30个循环；72℃ 1min；4℃ 10min，双酶切后将aFGF片段连入pCAPE2得到目的载体pCAPE2-aFGF，将其转入农杆菌GV3101中，挑取经鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPE1单菌落，分别接种于5ml含有50mg/L卡那霉素，12.5mg/L四环素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃过夜培养；次日，按照1:50的比例将1ml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，选择OD₆₀₀值范围在1.0-1.2的菌液于常温下4000rpm，10分钟离心收集菌体，菌体沉淀用含有终浓度100μM乙酰丁香酮、10mM NaCl、1.75mM CaCl₂，、250μlTween20、pH5.6的无菌水溶液重悬；将GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPE1两种菌体的重悬液1∶1混合，于室温放置90分钟后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子，设置侵染条件为无伤害处理，菌液浓度OD₆₀₀＝1.0-1.2、真空压力为0.08MPa、真空时间为1分钟；将侵染后的种子播种于土壤中，并以1)中以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬时表达体系为参照依据，于侵染后12-14天的最佳时间收获外源蛋白。