[发明专利]烟草野火病病原菌hrpZ基因及其表达产物与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，更具体地说，涉及一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpZ基因的克隆及其表达产物，以及该基因与其表达产物在植物获得抗病虫害方面的应用。

背景技术

微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物，按照作用机理的不同又可分为传统微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。传统微生物蛋白农药主要是来自苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白(ICP)，新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质，它与传统微生物蛋白农药最大的区别在于其不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫基因的表达，并促进植物的生长发育。目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白农药主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受关注、最有应用前景的是Harpin类蛋白激发子。Harpin蛋白主要是由欧文氏杆菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomanas)、黄单孢菌属(Xanthomonas)等细菌产生的一类能激发植物过敏反应的蛋白质，其可诱导植物体内一系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫系统，从而使植物能抵御多种病害的侵染和逆境的胁迫，并获得促进生长发育和提高增产的效果。1992年，美国康乃尔大学的韦忠民等首先从梨火疫欧文氏杆菌(E.amylovora)中克隆出这类过敏蛋白基因，迄今为止，所有这些Harpin类蛋白差不多都具有以下分子特征：(1)亲水性；(2)对热稳定，100℃处理10min不会失活；(3)对蛋白酶K和紫外线敏感；(4)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)无四级结构。

最近的研究表明，Harpin类蛋白可能在植物的信号通路中起着重要作用。研究人员用Harpin处理拟南芥，发现拟南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn离子通道以及各种氧化酶被激活，这些氧化酶包括ACC合成酶、抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侣前体等等。现在通常认为，植物细胞壁中广泛存在Harpin蛋白的受体，即Harpin结合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通过与这些受体蛋白HrBP结合激活植物中的多条信号通路。这些信号通路大致可以分为以下三类：(1)与植物抗病和驱虫相关的信号通路的激活，包括过敏反应与细胞死亡、离子交换通道、水杨酸途径、茉莉酸途径、苯丙氨酸解氨酶介导的途径以及其它一些抗性基因介导的途径；(2)与促进植物生长相关的信号通路的激活，包括一般的生长调节因子、胚轴延伸转录因子、生长转录因子、乙烯反应元件结合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)与植物抗逆相关的信号通路的激活，包括热休克蛋白、COR基因和耐盐锌蛋白等。另外可能还存在一条比较特殊的不依赖于NPR1介导的植物对细菌抗性的信号通路。

Harpin蛋白虽然来源于病原菌，但作为一类非特异性的激发蛋白因子，却能引起非寄主植物发生过敏反应，并诱导其抗病性、驱虫性和抗逆性的增加，以及促进生长发育、提高产量等。在转hrpN_Ea基因的梨上，Harpin_Ea对产生梨火疫病的宿主寄生菌E.amylovora也表现出非常强的抗性。

现代分子植物病理学揭示，植物病原细菌既有其致病性，也有诱导植物产生抗病性和促进生长的能力，而决定这种能力的基因是植物病原细菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response on non-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性。HR是植物一种局部的、快速的细胞编程死亡形式，是植物主动抗性的结果，其抗性作用不仅表现在对病原细菌侵染扩展的限制，而且能进一步诱导植物体内产生类似免疫机制的系统获得性抗性反应。