[发明专利]烟草野火病病原菌hrpZ基因及其表达产物与应用

权利要求书

1、一种烟草野火病病原菌hrpZ_Psta基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

2、如权利要求1所述的烟草野火病病原菌hrpZ_Psta基因在调节植物生长发育和使植物获得广谱抗病虫性方面的应用。

3、如权利要求1所述的烟草野火病病原菌hrpZ_Psta基因的克隆方法，包括下列步骤：

(1)提取烟草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的基因组DNA，根据Genebank中登录号为AB112555的hrpZ序列，设计完整开放阅读框(ORF)引物：

hrpZ-P1：5′-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC；

hrpZ-P2：5′-TCACCATTGGAATTGCTGTTG。

(2)以烟草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的基因组DNA为模板进行PCR扩增；反应条件为94℃变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸35s，循环35次，72℃延伸10min，4℃保存；

(3)将PCR产物与PTA2载体连接得PTA2-hrpZ重组体，转化到大肠杆菌菌株top10中，经PCR及酶切鉴定得阳性转化子；

(4)提取阳性重组质粒pTA2-hrpZ的DNA并测序。

4、如权利要求1所述的烟草野火病病原菌hrpZ_Psta基因的表达方法，包括下列步骤：

(1)根据所得的hrpZ基因的开放阅读框(ORF)，设计扩增ORF(剔除起始密码子)的引物P3和P4，在5′端分别引入BamH1和EcoR1酶切位点：

hrpZ-P3：5′-GGGGATCCCAGAGTCTCAGTCTTAAC(BamH1)；

hrpZ-P4：5′-GGGAATTCTCACCATTGGAATTGCTG(EcoR1)；

以阳性重组质粒pTA2-hrpZ为模板，PCR扩增，产物经BamH1和EcoR1双酶切处理，插入到载体PGEX-4T-1的BamH1和EcoR1酶切位点之间，使得hrpZ_psta基因与PGEX-4T-1上的还原型谷胱甘肽标签形成融合基因，从而得到原核表达质粒PGEX-hrpZ_psta；

(2)表达质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，在LB培养基(Amp100ug/mL)中37℃振摇(120～250r/min)培养至OD₆₀₀＝0.5～0.8，取400～500ul接种于30ml LB表达培养基(Amp100ug/mL)中培养2～3h后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养3～5h。取诱导的菌液1.5ml于1.5ml的离心管中离心1min，去除上清，将沉淀加入50ul 2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，取30ul进行SDS-PAGE，检测目的蛋白的表达情况。

5、如权利要求1所述烟草野火病病原菌hrpZ_Psta基因编码的Harpin蛋白质，其特征在于：该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

6、烟草野火病病原菌hrpZ_Psta基因编码的Harpin蛋白质在调节植物生长发育和使植物获得广谱抗病虫性方面的应用。