[发明专利]从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于天然药物化学物质或药品原料的制造方法，具体涉及一种以红豆杉细胞悬浮培养液为原料分离紫杉醇的方法。 

背景技术

紫杉醇是一种疗效显著的天然抗肿瘤、抗AID相关的卡波西肉瘤(Kaposi′s Sarcoma)的活性物质，属于红豆杉属植物或细胞产生的二萜类次生代谢产物，它的结构非常复杂，通过化学全合成生产很不现实。从一开始发现到现在，人们主要从红豆杉树皮或者枝叶中提取紫杉醇，但由于紫杉醇在红豆杉中的合成和积累过程漫长且复杂，即使在公认较高的百年生红豆杉树皮中，紫杉醇的含量也在0.06％以下，大量剥取树皮将对红豆杉资源产生毁灭性的破坏；目前组织提取法主要考虑的是采集红豆杉可再生的枝叶部分进行提取，尽管这条来源暂时可以缓解紫杉醇资源的压力，但红豆杉枝叶再生周期一般为2～5年，依据这条途径仍无法从根本上解决紫杉醇稳定来源问题。相比之下，利用红豆杉植物细胞的大规模培养方法不受季节和土地资源的限制，紫杉醇的合成的能力理论上是可以调控的，因此，这种方法是彻底解决紫杉醇来源问题的最有希望的途径。 

植物细胞大规模培养生产紫杉醇的一个显著特点是培养液体积庞大，紫杉醇在培养液中的含量比较低，一般在20mg/L左右，它既有一部分分泌到培养液中，还有一大部分存留在细胞中。王君健等提出的细胞培养生产紫杉醇的方法，公开号为CN1096820，只针对细胞内的紫杉醇，将收获期的细胞与培养液分离(离心、或过滤)，然后将细胞烘干后供提 取，在这种方法中，那些因分泌或部分细胞破裂流失到培养液中的的紫杉醇将被丢弃。王国亮等所提出的从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，公开号为CN1305999；以及Wu，J.；Lin，L.Enhancementof taxol production and release in Taxus chinensis cellcultures by ultrasound，methyl jasmonate and in situ solventextraction.Applied Microbiology and Biotechnology，2003，62(2-3)：151-155；针对分泌到培养液中的紫杉醇进行树脂富集。Yu，Guang’ao；Mei，Xingguo；Ke，Tie；Chen，Jing.Research ondifferent solvent extraction of taxol from Taxus cell.Huazhong Li gong Daxue Xuebao，2000，28(11)：83-84.用大量有机溶剂对培养液进行液-液萃取。这些方法必然会导致大量有机溶剂耗费和环境忧患，还要投入大量资金用于购置大尺寸的液-液萃取设备。 

发明内容

本发明提供一种从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，目的在于减少胞外紫杉醇的流失，提高原料利用率，降低成本和环境污染。 

本发明的一种从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，包括： 

(1)细胞匀浆步骤：将收获期的红豆杉细胞悬浮培养液过滤，分离细胞与培养液，用匀浆机将细胞破碎为匀浆，然后加入原培养液中，获得红豆杉细胞悬浮匀浆； 

(2)膜分离步骤：将红豆杉细胞悬浮匀浆先通过孔径小于等于10μm的滤膜过滤，得到细胞残片滤渣和滤液；滤液通过相对分子质量截留值为15000～25000的超滤膜过滤；流出的滤液再通过相对分子质量截留值为1000～5000的超滤膜过滤，后两次超滤膜过滤压力为0.1-0.4MPa，温度为20℃～30℃，后两次超滤膜过滤后滤液浓缩倍数10-30倍，将细胞残片滤渣和后两次超滤膜上浓缩物合并，得到膜分离截留物； 

(3)紫杉醇提取步骤：将膜分离截留物在30℃～60℃温度下烘干至含水量小于5％，研磨成粉末，加入提取溶剂，在常温下用超声波辅助提取，过滤，回收滤液溶剂，得浸膏； 

(4)大孔吸附树脂富集步骤：用甲醇或乙醇溶解浸膏，加载到大孔树脂柱上，用体积百分比含甲醇20％～40％的水溶液冲洗，除去水溶性杂质和色素，用体积百分比含甲醇60％～80％的水溶液洗脱，收集3倍柱体积的洗脱液，将洗脱液中的甲醇蒸干，加入等体积的萃取溶剂进行液-液萃取，收集有机溶剂层，蒸干，得到大孔树脂柱富集紫杉醇粗品； 

(5)精分离步骤：用正相层析和反相层析相结合对紫杉醇粗品进行分离，得到纯度大于98％的紫杉醇。