[发明专利]从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法

权利要求书

1.一种从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，包括： 

(1)细胞匀浆步骤：将收获期的红豆杉细胞悬浮培养液过滤，分离细胞与培养液，用匀浆机将细胞破碎为匀浆，然后加入原培养液中，获得红豆杉细胞悬浮匀浆； 

(2)膜分离步骤：将红豆杉细胞悬浮匀浆先通过孔径小于等于10μm的滤膜过滤，得到细胞残片滤渣和滤液；滤液通过相对分子质量截留值为15000～25000的超滤膜过滤；流出的滤液再通过相对分子质量截留值为1000～5000的超滤膜过滤，后两次超滤膜过滤压力为0.1-0.4MPa，温度为20℃～30℃，后两次超滤膜过滤后滤液浓缩倍数10-30倍，将细胞残片滤渣和后两次超滤膜上浓缩物合并，得到膜分离截留物； 

(3)紫杉醇提取步骤：将膜分离截留物在30℃～60℃温度下烘干至含水量小于5％，研磨成粉末，加入提取溶剂，在常温下用超声波辅助提取，过滤，回收滤液溶剂，得浸膏； 

(4)大孔吸附树脂富集步骤：用甲醇或乙醇溶解浸膏，加载到大孔树脂柱上，用体积百分比含甲醇20％～40％的水溶液冲洗，除去水溶性杂质和色素，用体积百分比含甲醇60％～80％的水溶液洗脱，收集3倍柱体积的洗脱液，将洗脱液中的甲醇蒸干，加入等体积的萃取溶剂进行液-液萃取，收集有机溶剂层，蒸干，得到大孔树脂柱富集紫杉醇粗品； 

(5)精分离步骤：用正相层析和反相层析相结合对紫杉醇粗品进行分离，得到纯度大于98％的紫杉醇。 

2.如权利要求1所述的从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，其特征在于，所述细胞匀浆步骤的过程为：将培养液用砂芯漏斗或工业板框过滤，分离细胞与培养液，用匀浆机在5000～20000r/min的转速 下将细胞破碎为匀浆，破碎时间1～3min，将匀浆后的糊状流体加入原培养液中，得到红豆杉细胞悬浮匀浆。 

3.如权利要求1所述的从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，其特征在于：所述膜分离步骤中，所述分子量截留值为15000～25000的超滤膜和分子量截留值1000～5000的超滤膜材料采用聚丙烯中空纤维膜丝材料或者改性聚砜膜丝材料。

4.如权利要求1所述的从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，其特征在于：

所述紫杉醇提取步骤中，所述提取溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、二氯甲烷中的一种，或者是体积比为9∶1或1∶9的甲醇与二氯甲烷的混合物。

5.如权利要求1所述的从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂富集步骤中：

所述萃取溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一种；

所述大孔树脂柱内的吸附树脂为国产D-401，DK-110A，HD-2的一种；

所述大孔树脂柱径高比为：1∶10～1∶20，上样量为60mg～80mg浸膏/g干树脂。

6.如权利要求1所述的从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，其特征在于，所述精分离步骤中：

所述用正相层析和反相层析相结合为氧化铝层析和C18反相层析的结合，正相层析用二氯甲烷∶甲醇体积比98∶2为流动相；反相层析采用C18预制柱、用含甲醇80％的醇水溶液作流动相。