[发明专利]天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术分离处理方法，尤其涉及天然芸苔素内酯的生物酶解 制备方法，用于处理从蜂蜡中获得甾体类植物生长调节剂--芸苔素内酯类物质。

背景技术

芸苔素内酯类物质(Brassinolide，简称BR)又名油菜素内酯，是美国Mirchell 博士等人，于1970年首次从油菜花粉中分离发现。经深入研究证明，芸苔素内 酯有多种独特的调节植物生长的生理活性，与已知的生长素、细胞分裂素、赤 霉素(920)、脱落酸、乙烯等植物生长调节剂相比，生物活性更强，使用量更 低，安全性更高，在农业上增产增收的效果更好。1982年第八届国际植物生长 物质大会上，被一致公认为新一代农业生产资料即世界第六大植物生长调节剂。

Grand和Mandeve等各国科学家在600多种植物花粉中分离出这种具有生 理活性的芸苔素内酯化合物，并进一步证明具以下基本结构加上不同的侧链基 团，构成的4种同系物生理活性最强。芸苔素内酯的化学结构：

芸苔素内酯为特殊的立体化学结构，已经证实任何一种化学合成方法，只 能得到一种与之相近而不是完全相同的化合物，化学合成无法在立体结构上做 到与天然物质的立体化学结构完全相同，这就大大降低了其效果。而且化学合 成法的生产工艺时间长，反应物不易提纯，对环境有污染，生产成本高。

从生物源中提取芸苔素内酯，如从蜂蜡、榨油后的饼渣中提取，专利 85102899以蜂蜡采用NaOH皂化，盐酸中和，硅胶柱层析分离的方法。但此方 法使用大量的四氯化碳、氯仿作萃取溶剂，消耗大量的酸碱，环保压力巨大， 严重危害工人健康，污染环境，而且生产消耗大，生产成本相对较高，副产物 作为废物不能综合利用，不能适应市场的需求。

发明内容

针对上述现有合成技术的不足，本发明的目的是提供一种原料易得，工艺 操作简便，生产过程能耗低，产品纯度高，环保节约的芸苔素内酯制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现的：

芸苔素内酯的生物酶制备方法，经过下列步骤：

A、在培养基中接种假单胞菌液，调节液温至25～30℃，搅拌40～50r/min；

B、通气培养，发酵时间15～25h；

C、发酵规模从2L放大至100L、500L罐，加入发酵液体积从0.8L、40L扩 大到200L，酶活力达到900～1400U/L；

D、反应发酵液加入絮凝剂再离心除去菌体，获得粗酶液；

E、粗酶液经中空纤维系统超滤浓缩，同时去掉无机盐及部分小分子物质， 得到2000～2500U/L的浓缩酶液；

F、将浓缩酶液加到分散的蜂蜡乳化液中，调pH7.0～8.5，搅拌，升温到30～ 40℃，定向水解不少于3h，水解接近终点时，加入适量的生成物萃取剂；

G、酶解液经乙醇萃取，板框压滤机过滤，浓缩罐浓缩后，采用吸附树脂柱 分离纯化，真空浓缩，结晶，得到99％芸苔素内酯产品。

所述的步骤A中的培养基组成为，油脂0.75％，NaNO₄0.2％，酵母膏0.5％， K₂HPO₄0.2％，消泡剂0.010～0.018％，pH7.5。

所述的步骤A中所用菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，购买 自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.867。

所述的步骤F中蜂蜡乳化液制作工艺为每100L水中，加入蜂蜡20～30kg， 乳化剂0.6～0.9kg，在70～80℃搅拌50～60r/min，乳化2～3h。