[发明专利]一种猪粪样总DNA的提取方法

说明书

[发明领域]

本发明属于微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及从猪粪便样品中提取总DNA的方法。

[背景技术]

哺乳动物肠道中存在约30个属500多种不同的细菌，约1×10¹⁴个活细菌，形成了复杂而动态平衡的微生态系统，对宿主营养物质的消化、吸收及免疫机制激活、生长发育等都起着十分重要的作用。若这种微生态平衡失调，则动物机体正常的生理功能就会发生紊乱，导致疾病的发生、流行，对畜牧养殖业尤其是规模化养殖产生了极大的潜在威胁。因而，近年来对肠道微生物区系结构及其多样性研究成为当前的热点，但由于肠道的特殊生存环境，使得肠道中有60％-80％的微生物是目前无法用传统的分离培养技术进行研究，从而阻碍了人们对肠道微生物结构及其多样性的客观认识。

随着现代分子生物学技术的发展及其在微生态学研究中的应用，人们能避开了传统菌的群分离培养过程，直接从DNA水平上对这些肠道菌群进行相关研究，因此，获得高质量、具有代表性的肠道菌群总DNA就成为这些研究的前提和重要技术手段。但由于粪便不但组成成分复杂(含有多聚糖、胆酸、胆盐、胆色素等PCR的强抑制物)，而且粪便中细菌类型数目繁多，而不同细菌因其各自独特的细胞壁成分和结构，又对不同的提取方法的敏感程度有所差异，从而导致了不同方法的提取效率不尽相同，进而使得肠道菌群多样性分析结果不尽如人意，甚至造成偏差(参见：刘健华等人.肠道菌群多样性梯度凝胶电泳分析法的建立，中国兽医科技，2005，35(6)：445-449)。目前粪便样品总DNA并没有标准、统一的提取方法，因而，选择较好的DNA提取方法对肠道微生态研究非常关键。

目前，国内外常用的DNA提取方法主要包括机械法，如硅珠法、冻融法等(参见：Schuurman T，Richard de Boer，Rachèl Patty，et al.Journal of Microbiological Methods，2007，71：238-245；刘健华等人.肠道菌群多样性梯度凝胶电泳分析法的建立，中国兽医科技，2005，35(6)：445-449)；化学法，如SDS法、苯酚法等(参见：Chris M，Denys B，Dietmar S.AnalyticalBiochemistry，2006，348：160-162；Burtscher MM，KE，Sommer R，et al.Journalof Microbiological Methods，2006，67：281-293)；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等(参见：JoyceMS，Vance JM.，BryanAW，et al.Journal ofMicrobiological Methods，1999，36：167-179)和商业试剂盒法，如Bio 101；C+T kit，Macherey-Nagal；QuantumGenomic DNA isolation kit，Bio-Rad；stool minikit，Qiagen等(参见：Alexandra L.M，Michelle J，Anthony R.B.Journal of MicrobiologicalMethods，2002，50：131-139；Pluske JR，Durmic Z，Payne HG et al.LivestockScience，2007，108：113-116)。这几种类型的DNA提取方法中，机械法、化学法及酶或其组合方法是实验室常规提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超声波或反复冻融来裂解细胞释放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、二氧化硅等进行DNA的抽提，最后无水乙醇沉淀。这几种常规的提取方法的优点是：原理清楚，便于分析及查找实验中出现的问题，而不足在于所提取的DNA纯度不高或者得率较低，常含有大量的PCR抑制物，需要进一步纯化处理才能用于后续的实验操作，如Savill等(参见：SavillM G，Murray S R，Scholes P，et al.Journal of Microbiological Methods，2001，47(3)：355-368)用蛋白酶K裂解粪便的同时还另外用十六烷基三甲基溴化铵来除去PCR反应抑制物，并且还用酚-氯仿进行了多次的抽提才得到较高纯度的总DNA；Ernest等(参见：Ernest HB，Penedo MC，May BP，et al.Molecular Ecology，2000，9：433-441)在用蛋白酶K提取粪便样品总DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子来纯化所得到的总DNA。试剂盒法虽然操作简单，但所提总DNA浓度、得率低，价格较昂贵、缺乏实验室通用性，不适于用于大规模粪便样品总DNA提取。另外由于专利等其它原因，试剂盒中具体成分及其含量不是很清楚，如果发生操作失败，很难分析找出实验失败原因(参见：哩申剑，张宝让，魏华等.三种粪便总DNA提取方法的比较.中国微生态学杂志，2008，20(1)：28-35)。