[发明专利]一种猪粪样总DNA的提取方法

权利要求书

1.一种猪粪样总DNA的提取方法，其方法特征在于按如下步骤操作：

(1)取适量经过预处理的粪便样品菌悬液于1.5或2ml离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清；

(2)加入0.8～1.5ml经60～70℃预热的裂解液及适量浓度的β-巯基乙醇溶液，混匀后60～70℃水浴0.5～1h，每隔几分钟取出摇匀一次；

(3)12,000rpm离心5min，离心后，移出上清于另一无菌1.5或2ml离心管中，弃沉淀；

(4)向上清中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，10,000rpm离心10min，取上清至另一无菌1.5或2ml离心管中；

(5)加入等体积的氯仿，混匀后于10,000rpm离心10min，再取上清；

(6)向上清中加入0.1倍体积的3M NaAC，混匀后再加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置30min以上；

(7)12,000rpm离心5min，弃上清，所得DNA沉淀在室温下晾干；

(8)用75％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于100μl TE中，加RNaseA至终浓度为20μg/ml，37℃消化30min，之后于-20℃保存，备用；

(9)以步骤(8)所得的DNA为模板，以16S rDNA特异性引物P0：

5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，和1492r：

5’-CGGCTTACCTTGTTACGACTT-3’扩增出粪便16S rDNA特异性条带并进行电泳检测。

2.权利要求1所述的粪样总DNA提取方法中，所述的裂解液的特征在于按以下配方配制：100mM Tris-HCl、1.4M NaCl、20mM EDTA、2％CTAB、1％～4％PVP-40，使用前须在60～70℃下预热。

3.权利要求1所述的粪样总DNA提取方法中，所述的β-巯基乙醇溶液的特征在于：其用裂解菌体时的浓度(v/v)范围为1％～3％，且需单独添加于菌悬液中。

4.权利要求1所述的粪样总DNA提取方法中，其所述的粪样预处理的特征在于按如下步骤操作：

(1)称取适量的粪便样于一无菌的50ml离心管A中，加入10～20ml PBS缓冲液及无菌的玻璃珠一起涡漩混匀；

(2)在200～400×g下离心2～8min后，尽可能多的取出上层悬液于另一无菌的50ml离心管B中；

(3)将步骤(2)所得的沉淀再用适量的PBS缓冲液重洗一次，并于200～400×g下离心2～8min，取出上层悬液合并于离心管B中；

(4)加适量体积的一定浓度的多聚甲醛溶液溶液于离心管B中，并将其置于4℃孵育1～2h；

(5)然后，6000～10000×g离心5～10min，弃上清，所得菌体沉淀用适量的预冷的P溶液重悬，混匀后，于-20℃下保存30min以上；

(6)在6000～10000×g离心5～10min后，弃上清，再用适量的PBS缓冲液对所得菌体沉淀重新洗涤，之后再离心，弃上清，收集菌体沉淀；

(7)所得的菌体沉淀用适量的TE缓冲液重悬，混匀后即得经预处理的粪便样品菌悬液，可用于总DNA的提取。

5.权利要求2所述的粪便样品预处理中，所述的多聚甲醛溶液的特征在于其按以下配方制备：取多聚甲醛1～6g，置于烧杯中，加入80ml 0.01mol/L PBS溶液后，55～65℃下磁力搅拌，使其完全溶解，并加入少许NaOH溶液至溶液清亮，用0.01mol/L PBS定容至100ml，于室温放置。

6.权利要求2所述的粪便样品预处理中，所述的P溶液的特征在于按以下方式配制：用等体积的PBS缓冲液及无水乙醇混合，并置于-20℃下保存，备用。