[发明专利]一种八肽胆囊收缩素的制备方法

说明书

技术领域：

本发明属多肽化学领域，特别涉及一种八肽胆囊收缩素(辛卡利特)的固相制备方法。

背景技术：

胆囊收缩素(CCK)是一种具有多种分子形式且有双重分布的脑肠肽，具有激素和神经递质的作用。八肽胆囊收缩素(辛卡利特，Sincalide)具有整个胆囊收缩素的全部生物活性，且活性要强2～10倍，其序列为H-Asp-Tyr(SO₃H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂。胰腺功能不足的病人和胃素瘤患者血浆CCK浓度增高，此外，CCK还参与中枢神经系统的发病。近年来合成的辛卡利特被广泛应用于诊断胆囊和胰腺的功能。辛卡利特的制备方法主要分为酶法和化学法两类。

(1)酶法

酶法合成是以木瓜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等酶系多酶联用，采用片段缩合的方法合成辛卡利特，其中一些氨基酸原料的制备及多肽保护基的脱除仍需化学法辅助才能完成。此类方法主要参见以下文献：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1982，79：2840；Chem.Pharm.Bull.1988，36：3915；CollectionCzechoslovak Chem.Commun.1988，53：1086等。酶法存在的主要问题是：单纯的酶法不能完成辛卡利特的合成，需要联用化学方法方可合成目标产物；酶法涉及酶制剂种类较多(如木瓜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶)，且酶制剂价格昂贵，不易得；酶法生产属于液相合成范畴，中间产物分离麻烦，制备周期长。因而目前辛卡利特的生产已几乎不再采用酶法，而主要以化学方法为主。

(2)化学合成法

化学合成法可采用液相缩合片段，然后磺酸化的方式，也可以固相合成多肽序列后再磺酸化，或者合成磺酸化多肽序列后再酸解脱除肽链保护基的方法。此类方法主要参见以下文献：Journal of Medicinal Chemistry，1970，13(3)：349-352；Pept.：Struct.Funct.，Proc.Am.Pept.Symp.，9^th.1985，241-244；International JournalofPeptide & Protein Research，1991，38(6)：555-561；生物化学杂志，1991，7(4)：436-440；中国药物化学杂志，1993，(1)：39-41；International Journal of Peptide &Protein Research，1994，43(2)：190-200。当前化学法中存在的主要问题是：合成后 再磺酸化的方法属于液相合成范畴，操作步骤多，中间产物分离麻烦，制备周期长，且反应中容易产生副产物导致辛卡利特产率下降；使用TFA脱除侧链保护基时，多肽上的磺酸酯键容易断裂，导致辛卡利特分解，产率及纯度下降。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、高效的辛卡利特制备方法，解决目前辛卡利特制备工艺繁琐、周期长、产物酸解时易分解的问题。一种辛卡利特的制备方法，具体技术方案如下：

(1)制备保护的辛卡利特-树脂复合物

向带有过滤装置的容器中加入树脂a。向所述容器中加入溶剂DMF，浸没树脂，静置1h，过滤。

于辛卡利特的C端氨基酸及酯化试剂中加入溶剂DMF溶解。然后将所得的溶液加入到所述的a中，20℃下反应5h。反应结束后，过滤。然后加入溶剂DMF，洗涤树脂三遍，过滤，得到b。所述的酯化试剂为DIC、HOBt和DMAP，其中各反应物物质的量之比为n(C端氨基酸)：n(DIC)：n(HOBt)：n(DMAP)：n(树脂)＝4：4：3：0.5：1。

在b中加入20％v/v PIP和DMF混合溶液，进行脱保护反应，20℃下反应0.5h。反应完毕后，过滤。然后加入DMF洗涤树脂，过滤，得到c。

向反应器中加入C端第二个氨基酸和缩合试剂HBTU、HOBt和DIEA，20℃下反应1h，进行缩合反应。反应结束后加入DMF洗涤树脂，过滤，得到d。其中所述的反应物物质的量之比为：n(氨基酸)：n(HBTU)：n(HOBt)：n(DIEA)：n(树脂)＝3：3：3：6：1。

按照辛卡利特C端到N端的顺序，更换氨基酸，循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的辛卡利特-树脂复合物e。其中所述的反应物物质的量之比为：n(氨基酸)：n(HBTU)：n(HOBt)：n(DIEA)：n(树脂)＝3：3：3：6：1。