[发明专利]一次性测定生物体中十种氨基类生物活性物质的方法

说明书

技术领域

本发明属生物化学检测领域，特别是涉及神经内分泌免疫网络生物活性 分子的测定，尤其是生物体中(如血液或脑组织)氨基类生物活性物质的测 定方法。

背景技术

中医药的整体调节作用与神经内分泌免疫网络密切相关，而肾上腺素 (E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羟色胺(5-HT)、组胺(HA)、 谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三 碘甲状腺原氨酸(T₃)等十种氨基类生物活性物质是对于研究神经内分泌免疫 网络具有重要意义的因子。

肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羟色胺(5-HT)、 组胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸 (Gly)和三碘甲状腺原氨酸(T₃)等十种氨基类生物活性物质的分子式中均 有氨基，丹酰氯能与氨基类化合物反应形成具有荧光的衍生物，可用于微量 活性物质的测定。以丹酰氯为衍生试剂测定血液中某一个氨基或者某几个氨 基酸的文献国内外均有报道，但将血液中氨基酸类和单胺类递质一起，以丹 酰氯为衍生试剂检测的色谱条件国内外未见报道；将氨基酸类和单胺类递质、 组胺、三碘甲状腺原氨酸一起，以丹酰氯为衍生试剂检测的色谱条件国内外 未见报道。

将神经内分泌免疫网络中的肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺 (DA)、五-羟色胺(5-HT)、组胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、 γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲状腺原氨酸(T₃)等十种氨基 类生物活性物质按照的常规检测方法测定：如高效液相色谱—电化学检测肾 上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)等儿茶酚胺类神经递质；用 邻苯二甲醛为荧光衍生试剂高效液相色谱荧光检测法测定氨基酸类神经递 质；用放免法测定三碘甲状腺原氨酸等，一方面由于方法各异，因此，需要 被检测的样本量会比较大，增加实验成本；另一方面，由于不同的检测方法， 样品前处理步骤不同，检测的原理不同，会导致统一分析检测指标的变化时， 实验的系统误差增加。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种一次性测定生物体中十种氨基类 生物活性物质的方法。本发明采用丹酰氯为衍生试剂一次性测定肾上腺素 (E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羟色胺(5-HT)、组胺(HA)、 谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三 碘甲状腺原氨酸(T₃)等十种氨基类生物活性物质，使生物体中肾上腺素等氨 基类生物活性物质的测定更加方便快速。

为了解决上述技术问题，本发明提供的一次性测定生物体中十种氨基类 生物活性物质的方法，包括如下步骤：

将生物体液经去蛋白处理后，加入KHCO₃溶液调PH值后，再加入和调PH 后溶液体积相同的、浓度为2-10mg/ml的丹酰氯进行衍生化反应，反应温度 为80℃水浴，反应时间为20分钟；

利用高效液相色谱仪和荧光检测器完成对肾上腺素(E)、去甲肾上腺素 (NE)、多巴胺(DA)、五-羟色胺(5-HT)、组胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬 氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲状腺原氨酸(T₃) 十种氨基类生物活性物质的检测，其中，

色谱条件为：

色谱柱：Hypersil ODS(C18)色谱柱，型号250×4.6mm，5μm；

流动相：流动相B是甲醇∶乙腈＝2∶3；流动相A是20mmol/l的醋酸盐缓 冲液，其中加入3mmol/l的辛烷磺酸钠，0.1mmol/l的Na-EDTA，并用氢氧化 钠调至pH值4.8，用0.45um微孔滤膜过滤；

流速：1ml·min^-1；

柱温：30℃；

荧光检测器的激发波长为350nm，发射波长为510nm。

本发明中，液相色谱中采用梯度洗脱，梯度洗脱的条件如下表所列。