[发明专利]可检测多种有机磷农药残留的抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农业技术领域的农药残留抗体的制备方法，尤其是一种可检测多种有机磷农药残留的抗体制备方法。

背景技术

农药是当前农业生产用于防治病、虫、杂草对农作物危害不可缺少的物质，对促进农业增产有极重要的作用，但同时带来严重的环境问题：生态失衡，农产品品质下降，人类身体健康受威胁。目前，有机磷、拟除虫菊酯农药具有高效的杀虫效果，是植物化学保护的主力军。随着近年来环境保护的呼声越来越高，有机磷类农药使用带来的环境问题日益引起人们的重视。但就目前的形势而言，人类仍面临饥饿，贫穷的困扰，全面禁止农药的使用是不现实的，为了达到高产、高效的目标，农药的地位在短期内是无法取代的。鉴于此，为保障人民的身体健康，有效控制生产中农药的合理使用和对其残留量进行监控，开发一种快速、可靠、灵敏，适于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。目前有机磷类农药的残留分析方法主要是通过提取、净化后，再配以高效HPLC或GC，这种检测方法费用相对昂贵、样品前处理过程复杂、对仪器设备要求较高、而且需要消耗大量的有机溶剂，从而造成对环境的二次污染。免疫分析是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的一种检测方法。农药多为小分子化合物，需要通过与大分子蛋白类物质偶联后才可用于免疫动物，刺激动物免疫系统来产生针对小分子农药的抗体。由于大多数农药本身不具备直接同蛋白类大分子物质偶联的位点，因此，通常需要对农药进行改造，前期研发费用较高。而且，由于抗体通常特定物质的特异性较强，建立的免疫分析方法多只适用于单一农药残留量的检测分析，限制了免疫分析方法的应用，不能充分发挥免疫测定法的快速、操作简单、检测费用低的优点。

经对现有技术文献的检索发现，Alcocer等人在《J.Agric.Food Chem》(农业食品化学)48卷(2000年)2228-2233页上发表的“Use of Phosphonic Acid asa Generic Hapten in the Production of Broad SpecificityAnti-Organophosphate Pesticide Antibody”(以二乙基磷丁烯酸为通用半抗原制备抗有机磷农药广谱特异性抗体)，该文提及利用反式-4-(O，O-二乙基磷酰基)-2-丁烯酸作为有机磷农药通用半抗原，制备针对有机磷农药具有广谱特异性的抗体。所得到的多克隆抗体与二甲氧基磷酸酪类及硫代磷酸酪类化合物结合力较弱，对较多农药的检测灵敏度不高。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可检测多种有机磷农药残留的抗体制备方法，解决了目前农药残留免疫检测中存在的抗体通常对特定物质的特异性较强，建立的免疫分析方法多只适用于单一农药残留量的检测分析，限制了免疫分析方法应用的实际问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明包括如下步骤：

第一步，用O，O-二乙基硫代磷酰氯与4-氨基丁酸反应，合成含有多种有机磷农药共同结构-O，O-二乙基硫代磷酰基的通用半抗原O，O-二乙基-N-(3-羧基丙基)硫逐磷酰胺酯(DENP)；

第二步，采用碳二亚胺法将第一步得到的通用半抗原O，O-二乙基-N-(3-羧基丙基)硫逐磷酰胺酯(DENP)分别与牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)进行偶联，制备通用免疫原DENP-BSA和通用包被原DENP-OVA；

第三步，采用第二步制备的免疫原免疫新西兰大白兔，得到多克隆抗体，即可检测多种有机磷农药残留的抗体。

所述的第一步，具体为：

①取1.0gO，O-二乙基硫代磷酰氯溶于5mL甲醇，置于冰浴；

②称取KOH 0.69g和4-氨基丁酸0.67g，溶于5mL甲醇；

③在搅拌中，将氨基丁酸和KOH的混合溶液逐滴加入O，O-二乙基硫代磷酰氯溶液中，在冰浴中反应，过滤反应混合物，减压浓缩，然后用20ml NaHCO₃溶液将浓缩液转移到分液漏斗中，用10mL正己烷萃取，弃去有机相，再重复两次；

所述的在冰浴中反应，其时间为2h。

所述的NaHCO₃溶液，其浓度为50mg/mL。

④然后用盐酸调节水相pH＝2，用10mL二氯甲烷萃取有机相，再重复两次；

⑤经无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到淡黄色油状物0.53g，即为产物通用半抗原O，O-二乙基-N-(3-羧基丙基)硫逐磷酰胺酯DENP。

所述的第二步，具体为：