[发明专利]一种游离肝癌细胞的检测和分选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种游离肝癌细胞的检测和分选方法。

背景技术

肿瘤转移是一个多阶段、多步骤的复杂过程。存在于原发瘤和转移瘤之外的肿瘤细胞统称为游离肿瘤细胞(Isolated tumor cell，ITC)，亦称播散肿瘤细胞(Disseminated tumorcell，DTC)，包括淋巴结、骨髓和血液等组织中的单个或小簇肿瘤细胞。其中进入血流的又称循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，GTC)。

原发性肝细胞癌是我国最常见、多发的恶性肿瘤之一。尽管近年来治疗手段不断增加，但并没有从根本上改变肝癌高死亡率的状况。究其原因，转移复发率高是影响肝癌远期疗效的主要因素。肝癌细胞可以在很早期播散，大多通过血液和淋巴系统转移，甚至播散到胸水、腹水等体液中。因此，游离肝癌细胞检测可以作为肝癌早期诊断的一个标记物、作为肝癌细胞隐匿播散的一个确凿证据以及作为监测疗效和预测复发的一个独立指标。

以往通常采用RT-PCR检测白蛋白和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)mRNA来检测血循环中的肝癌细胞，但RT-PCR法有其固有局限，如特异性不高、操作耗时且难以标准化、不能估算样本中肿瘤细胞的数目等。

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种采用流式细胞仪对悬浮的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。其中，流式细胞分选技术又称荧光激活细胞分选技术(fluorescence-activated cell sorting，FACS)。目前FCM已被用于检测神经母细胞瘤、血液系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌病人的CTC。相比于RT-PCR法，FCM具有省时、操作易标准化等优点，并可进行CTC计数，因而可提供更准确的诊断信息。

遗撼的是，由于缺乏相应的肝癌细胞表面抗体，迄今未见FCM用于检测和分选游离肝癌细胞的报道。虽然从理论上讲上皮细胞表面抗体也可被用来检测和分选属于上皮类的肝癌细胞，但是这些抗体通常只能识别部分肝癌细胞。比如：上皮细胞表面抗体Ber-EP4单抗只能识别约67％的肝癌细胞(Latza U et al.Ber-EP4：new monoclonal antibody whichdistinguishes epithelia from mesothelial[J].J Clin Pathol，1990，43(3)：213-9.)。

Ashwell和Morell于20世纪60年代发现，哺乳动物的肝实质细胞膜表面存在一种肝结合蛋白——去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，又称半乳糖受体(Morell AG et al.Physical and chemical studies on ceruloplasmin.V.Metabolicstudies on sialic acid-free ceruloplasmin in vivo[J].J Biol Chem，1968，243(1)：155-159.)。ASGPR是一种跨膜蛋白，其胞外区含有糖识别区(carbohydraterecognition domain，CRD)，能专一性识别和结合以半乳糖残基和N-乙酰半乳糖胺残基为端基的糖蛋白(配体)。ASGPR主要表达于哺乳动物肝窦状隙的肝实质细胞表面，密度很高，每个肝细胞表面可多达500,000个受体。这一特性已被用于设计多种实验研究。比如，利用放射性核素标记上述糖蛋白进行肝显像；而以上述糖蛋白为载体介导基因或药物导向肝实质细胞，则是肝靶向治疗领域的一个研究命题。但至今未有基于ASGPR检测或分选游离肝癌细胞的报道。

因此，本领域迫切需要开发一种敏感性高、特异性强、易于操作，而又对受试者无损伤的肝癌细胞的检测和分选方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种游离肝癌细胞的检测和分选方法，以及本发明方法所分选到的肝癌细胞。

本发明的第一方面提供了一种肝癌细胞的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(a)采集样品；

(b)从样品中分离单个核细胞；

(c)以与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异结合的物质A与单个核细胞中的肝癌细胞结合，形成复合物B；

(d)以荧光素间接标记复合物B；

(e)用流式细胞仪检测样品中的肝癌细胞。

上述物质A选自ASGPR的配体或抗体。

上述步骤(b)中采取的分离方法为密度梯度细胞分离法。