[发明专利]增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的培养液及其制备方法。具体涉及一种增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液及其制备方法。

背景技术

造血干细胞在上世纪初被提出且应用于临床已经显示出它的治疗潜力，诸多的血液系统疾病在干细胞移植治疗后使病患的临床症状得以改善，患者的生存期显著的延长。造血干细胞的主要来源包括骨髓源造血干细胞、脐血造血干细胞、胎肝造血干细胞。由于造血干细胞来源不同，干细胞所具备的抗原性亦不同，主要表现为：骨髓源造血干细胞的抗原性(例如：HLA)强，植入体内的骨髓源造血干细胞，如果不经配型，首先宿主的免疫系统会对植入体内的造血干细胞产生排斥作用。输入的抗原性强的干细胞也会排斥宿主，强烈的排斥反应会引起一系列的系统性的免疫变态反应，并导致人体器官的功能障碍和衰竭。因此，骨髓源造血干细胞的植入必须将供体和配体的抗原型作完全比较后，在找出供体和宿主抗原“相同”或极“相近”者才能做细胞植入的治疗，这最终导致患者只有10万或百万分之一的机会寻找到符合自身细胞要求的供体，临床应用存在极大困难。

脐带血提供的造血干细胞由于抗原性较骨髓源造血干细胞弱，故理论上脐血造血干细胞是理想的具有临床治疗价值的干细胞，其机体排斥反应较骨髓源造血干细胞轻。由于脐血造血干细胞的数量有限，不能满足成人及大龄儿童患者植入干细胞修复机体的临床要求，由于脐带血造血干细胞体外增殖，尚存在诸多关键技术问题未解决，临床实际应用存在困难。与前两者相比，胎肝造血干细胞具有以下优势。第一，造血干细胞抗原性较脐血造血干细胞弱，所以干细胞抗原配型相对简易而且容易在小规模的人组织供体中寻获；第二，胎肝造血组织蕴含具有相当数量的干细胞(50～120×10⁶)，而脐血造血干细胞仅有1～2×10⁶，该数量的脐血造血干细胞仅能满足体重≤20公斤的患者植入要求；第三，干细胞的成活率高，分化性强。单位细胞产生的细胞集落均高于骨髓和脐血源性造血干细胞，纯化出的干细胞仅需ABO、HLA，六位点配型，便可以实际用于患者，其配型成功机率可高达25％。

经检索发现，中国专利申请号：02134314.4，公开号：CN1389566，名称：神经干细胞培养基及其制备方法，该项技术自述为：公开了一种神经干细胞培养基及其制备方法，由DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液、胰岛素、盐酸丁二胺、硒化钠、氢化可的松、L-谷氨酰胺、人转铁蛋白和黄体酮配制而成，具有使骨髓组织等不同来源种子细胞定向发育分化为神经干细胞功能，可随时准确无误地为医学科研教学及临床应用提供相关需要的神经干细胞。由于造血干细胞的CD34表达受微环境的作用影响较大，某些干细胞在部分周期内CD34表达极弱，而某些干细胞在同样的周期内CD34表达又很强(这种现象又称为“漂移表达”)。这种生物特性使用目前的纯化方法只能纯化CD34表达强的干细胞(通过荧光标记抗体或CD34分离试剂盒对CD34细胞进行标记等方法)，而在同一周期内CD34表达弱的干细胞，由于不能有效标记则被忽略，干细胞的这种生物特性(CD34表达)使得目前的纯化方法只能对那些经过标识的干细胞进行纯化，使得干细胞可纯化数量不稳定，且不能有效的纯化出足量的造血干细胞应用于临床，为患者提供多次治疗的机会。

该项技术作用是将一种具有使骨髓组织等不同来源种子细胞定向发育分化为神经干细胞功能的细胞培养基。由于神经干细胞在定向发育分化过程中细胞存在不确定性，经分化后的细胞是否继承并具有原干细胞特征尚不能确定，因此临床应用存在较大的风险。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液及其制备方法。本发明的培养液，其作用是对干细胞所具有的CD34表达特征实施强化表达，达到可标识、纯化的范围，从而极大地提高了干细胞可标识数量；本发明的制备方法，使原本造血干细胞中某些CD34表达弱的干细胞，重新显现出来，使原有的造血干细胞数量更多的显现出来，大幅提高了造血干细胞纯化数量，安全可靠，满足临床应用。

本发明所涉及的上述增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液，其组分和重量百分比为：

MEM：56.5％-64.7％；

RPMI-1640：29.4％-30.4％；

Hanks：5.88％-13.0％；

人类干细胞生长因子-2：470×10^-9％-1740×10^-9％；