[发明专利]一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法

说明书

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法。

技术背景

杆状病毒是自然界存在的一类天然宿主为鳞翅目和鞘翅目昆虫的病毒，被用作防治农林害虫的生物农药和在昆虫细胞中生产蛋白质的基因工程表达载体。其标准株为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus，简称AcMNPV)。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统最早由Smith & Summer于1983年建立¹，经过20多年的发展现在已经成为了一种最常用的真核细胞表达系统。其基本原理是将目的基因置于杆状病毒超量表达启动子的调控下，使目的基因在感染末期超量表达。杆状病毒感染昆虫细胞时，在感染的极晚期有两个蛋白质可以超量表达：多角体蛋白和p10蛋白。它们对病毒在体外培养细胞中复制都是非必须的，所以可以利用这两个基因的启动子启动目的基因的表达，可以在感染末期高水平地生产所需的蛋白。其主要的优点有^2，3：病毒遗传背景清楚；基因容量大，能承载较大目的基因；生物安全性好，天然情况下不能感染人类；表达目的蛋白效率高；可对表达的蛋白进行糖基化修饰；容易扩大规模，达到生产要求。迄今，已经通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功表达了各种目的基因数以千计，例如鸡胃酶解肌球蛋白⁴、视紫质激酶⁵、人类beta-干扰素¹等。综合其特点，杆状病毒是一种优良的蛋白表达载体，尤其适合于生物工程的酶类，药物类等活性蛋白的大规模生产。但是，杆状病毒载体表达目的基因时，其表达水平与天然的多角体蛋白的表达水平仍有非常大的差距，表明目的蛋白表达水平仍然有较大的提高空间。

染色质调控元件是一类通过调节DNA组蛋白的甲基化、乙酰化，及调节染色质区室化来改变DNA的高级结构，影响DNA的转录活性的序列。其代表包括绝缘子，如鸡的β球蛋白基因HS4绝缘子，果蝇的scs和scs’，gyp绝缘子等。它能阻止异染色质的扩散，以维持被保护基因的持续表达^6，7。目前绝缘子序列被广泛应用于血液病和神经系统疾病的基因治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法。

本发明提出的提高杆状病毒表达载体表达目的基因的方法，是在杆状病毒基因组中的适当位置插入真核细胞染色质调控元件的DNA序列。

本发明中，所述适当位置包括邻近目的基因表达框的上游一侧或下游一侧，或上、下游两侧，或其他合适的任何位置。

本发明中，所述的杆状病毒，包括但不限于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)。

本发明中，目的基因表达通过病毒感染细胞进行；其使用的细胞株包括但不限于草地夜蛾细胞系SF9；其表达的目的基因没有限制。

本发明中，所述的染色质调控元件包括但不限于和和绝缘子(insulator)(如鸡的β球蛋白基因HS4绝缘子，果蝇的scs和scs’，gyp绝缘子等)，抗抑制子(anti-repressor)，

本发明中，所述杆状病毒的构建方法但不限于Bac-To-Bac法等。

本发明插入染色质调控元件的DNA序列，这种序列能够在表观遗传学层面提高目的基因转录的水平，和目的蛋白质合成的水平。本发明将真核细胞染色质调控元件的DNA序列加入到杆状病毒基因组中目的基因表达框附近，得到改造的病毒。用改造后的病毒感染适当的细胞，在感染后48小时到96小时间，与未改造的病毒载体相比，目的蛋白的表达量明显增加。依不同目的蛋白，不同感染复数，不同蛋白收获时间及不同培养基使用量，目的蛋白表达量增加3～10倍。本发明适用于生产具有天然活性的蛋白质

附图说明

图1经改造的杆状病毒基因结构示意图。Ac-EGFP为作为对照的标准的重组杆状病毒，Ac-EGFP-I为插入绝缘子的重组杆状病毒。

图2带有绝缘子的重组杆状病毒Ac-EGFP-I和对照重组杆状病毒Ac-EGFP感染细胞后表达的eGFP蛋白被激发的荧光强度比较。

具体实施方式