[发明专利]一种检测石蜡标本DNA甲基化的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及医学生物学检测技术领域，具体是一种检测石蜡标本DNA甲基化的方法。

背景技术：

DNA甲基化异常与肿瘤的发生、发展密切相关。近年来有关DNA甲基化与肿瘤发生的关系日益受到人们的重视，成为肿瘤分子生物学研究热点之一。DNA甲基化的主要研究方法有甲基化特异性PCR。

以往实验多采用新鲜组织，研究样本来源有很大的局限性，而石蜡标本来源丰富，而且可以针对新课题做回顾性分析，弥补了新鲜组织标本存在的取材不易及保存困难等缺点，为临床和科研提供了有利的帮助，因此大大的方便了实验研究。

传统的从石蜡标本中制备检测DNA甲基化的方法，主要过程如下：

1、制备待测DNA：

1)脱蜡：将石蜡标本切片用二甲苯脱蜡2次，再用无水乙醇洗涤2次，组织干燥后，用基因组DNA抽提试剂盒制备DNA；

2)细胞裂解：加裂解液，在55℃下用蛋白酶K消化12-24小时；

3)抽提DNA：用酚氯仿抽提两次；

4)沉淀DNA：用无水乙醇沉淀，70％酒精洗涤，凉干备用。

2、DNA亚硫酸氢钠修饰：

1)DNA解链：将上述制备的DNA变性，成为单链DNA，使碱基充分暴露；

2)DNA亚硫酸氢钠修饰：将上述单链DNA与亚硫酸氢钠反应，使DNA单链上未甲基化的胞嘧啶被修饰成磺化胞嘧啶，脱氨基，该磺化胞嘧啶变为磺化尿嘧啶；而5’-甲基化胞嘧啶不能被修饰；

3)脱磺化：将修饰后的DNA产物经过透析脱盐，用氢氧化钠脱磺化，使得磺化尿嘧啶变为尿嘧啶，亦即原来没有甲基化的胞嘧啶碱基变为尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶不变。

3、纯化：

上述修饰的DNA用酒精沉淀、洗涤，用作PCR模板。

4、PCR扩增和检测分析：将纯化的DNA修饰产物溶解于TE，用设计的待测基因的正、反向甲基化特异性引物和未甲基化特异性引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物与标准品进行凝胶电泳检测或DNA测序分析，就可确定该基因的胞嘧啶甲基化程度。如果其中多数基因发生异常甲基化，则就提示该患者可能得相应的癌症。

具体步骤主要为：

1、制备待测DNA：按常规方法脱蜡和从组织中抽提DNA。

2、DNA亚硫酸氢钠修饰：

1)、取1μg DNA，溶于20μl水中，95℃水浴10分钟；立即放于冰浴；加入2μl 10M氢氧化钠，使DNA变性，成为单链DNA；

2)、加入亚硫酸氢钠修饰液230μl(3M亚硫酸氢钠，10mM氢醌，PH5.0)；置于55℃避光修饰16小时，DNA被修饰，未甲基化的胞嘧啶被修饰为磺化尿嘧啶。

3.DNA修饰产物的纯化：

1)将上述DNA修饰产物在4℃下用双蒸水透析过夜，去除多余的亚硫酸氢钠；

2)脱磺化：加入10M NaOH使其终浓度为0.3M，室温20分钟；再加入等当量的1M盐酸中和NaOH，磺化尿嘧啶脱磺化后成尿嘧啶；

3)沉淀：加入四分之一体积的10M醋酸铵和2倍体积乙醇，将DNA修饰产物置于-20℃沉淀过夜；

4)洗涤：13000rpm离心10分钟，弃上清，用70％酒精洗涤2次；干燥10分钟，得纯化的DNA修饰产物，亦即PCR模板。

4.PCR扩增和检测分析：

将纯化的DNA修饰产物溶解于20μlTE，用设计的待测基因的正、反向甲基化特异性引物和未甲基化特异性引物进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：

10x PCR buffer(without MgCl₂)  2.5μl

MgCl₂(25mM)                    2μl

dNTP(2.5mM)                    2μl

正向引物(20μM)                0.5μl

反向引物(20μM)                0.5μl

H2O                            16μl

模板                           1μl

Taq酶(5u/μl)                  0.5μl

总体积                         25μl

反应条件如下：

94℃3分钟

72℃5分钟