[发明专利]一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法。

背景技术

随着20世纪末期以来干细胞技术和理论迅猛发展，创伤引起的缺血性疾病以及创伤修复机制的研究和临床治疗面临着新的契机。研究表明：机体损伤后，血循环中具有多向分化潜能的干/祖细胞一方面可以在炎症细胞产生的细胞因子/生长因子作用下动员、增殖、迁徙入损伤器官，分化为相应的组织细胞进行损伤修复，另一方面，迁徙到损伤部位的干细胞还可以对不同的局部刺激(包括缺氧或缺血)作出生理反应，依次释放血管活性物质、生长因子以及参与免疫调节的细胞因子和趋化因子，参与创伤后的炎症反应。

研究表明，内皮细胞不仅是炎症反应的参与者，还是首先受损的靶细胞，并进而造成微血管损伤、微循环障碍，这可能是创伤后器官功能障碍的始发环节。1997年，Asahara等首先从外周血单个核细胞(PBMCs)里分离出一种被称为内皮祖细胞(EPCs)的祖细胞亚群，这些细胞具有在体内外增殖、迁徙和分化为成熟内皮细胞的能力。血循环中的EPC主要来源于骨髓，另外，循环中的多能干细胞也可以在细胞因子刺激下分化为EPC。目前认为，外周血中的EPC包含有两种形式：即刚被动员进入血循环早期EPC，它们都表达三种祖细胞分子标志：CD133、CD34和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)，之后循环中EPC则逐渐失去CD133表型和祖细胞特性，并开始表达内皮系的特征性分子标志：血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)和VIII因子(vWF)，从而分化为晚期EPC。

体外实验中，两种EPC都可以摄取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)，并结合内皮特异性植物血凝素(lectin)，这成为体外鉴定EPC的特异性表型。Hill等通过对外周血EPC体外培养后集落形成单位计数，来间接测定循环中EPC的数量，并认为内皮损伤后循环中EPC的水平可以影响心血管疾病的进程。大量的动物和临床实验都已经证明：当组织受到损伤时，尤其是缺血性损伤时，循环及组织中EPC动员和增殖能力增强，并可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修补裸露的血管内皮损伤区，并参与缺血或损伤组织内新血管生成，从而改善缺血器官的功能；而如果创伤后EPC的分化、迁徙功能发生严重障碍，则会导致损伤部位微循环严重损害而无法得到修复，甚至发生器官功能衰竭。

在以前的实验和临床研究表明，肌肉内注射VEFG表达质粒能促进缺血组织新生血管的形成，Iwaguro发现给患者肌肉注射VEGF表达质粒后循环血中内皮祖细胞增加了219％，提示增加的内皮祖细胞对新生血管的形成有关。他们收集健康成人的外周血单核细胞，在含有VEGF、bFGF、IGF、EGF的培养基里，7-10天后内皮祖细胞数量扩增了90倍。截断无胸腺裸鼠的单侧股动脉制成后肢缺血模型后心脏内注入人内皮祖细胞，发现移植了人内皮祖细胞的缺血后肢血流加快，缺血后肢的毛细血管密度显著增加，缺血造成的肢体坏死和肢体自身断离都分别减少60％。制成组织切片进行观察，发现内皮祖细胞参与了新血管的形成。将VEGF基因转入内皮祖细胞再移植，缺血后肢的血管新生进一步得到改善，缺血造成的肢体坏死和肢体自身断离比对照组减少了1/30。在骨髓移植小鼠皮下接种同系的结肠癌细胞，1周后发现肿瘤的新生血管网中有部分供体来源的内皮祖细胞，而且，内皮祖细胞参与了损伤处新血管的形成。在后肢缺血模型中，发现骨骼肌新生的毛细血管壁有供体来源的内皮祖细胞。永久性结扎的左前降支冠状动脉，发现内皮祖细胞参与心肌梗死边缘处的新血管形成。以上实验表明，出生后的新血管形成，不仅仅是现有血管出芽延伸的结果，骨髓来源的循环血中的内皮祖细胞也发挥了作用。目前逐渐开始应用EPC于临床治疗肢体缺血疾病。

在正常条件下，循环系统中EPC仅占单核细胞0.03～0.06％。局部的血管损伤、缺血、烧伤、创伤及细胞因子等均能刺激EPC从骨髓中动员出来，进入血液循环系统，迁移到损伤内皮处。生理学上认为局部缺血是介导EPC从骨髓动员的显著信号。近年来研究表明EPCs不仅参与胚胎期血管发生，在生后血管的生理或病理性重建中也发挥重要作用，特别研究发现EPCs在肿瘤血管生成过程中起着重要的作用。由于EPC有多种分化潜能，是机体创伤修复过程中不可缺少的组成部分，同时可以帮助恢复和重建动脉粥样硬化的血管内皮功能，防止动脉粥样硬化的进一步恶化，减少心肌梗死的发生。除此之外，EPCs还能够分泌多种促进新生血管生长的因子；如一氧化氮(NO)，EGF，成纤维细胞生长因子-4、9(FGF-4、9)，肝细胞生长因子(HGF)，白介素-8(IL-8)，VEGF等。