[发明专利]一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法

权利要求书

1、一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于该方法依次包括下述步骤：

A、取猪髂骨抗凝骨髓5-10ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出骨髓中单个核细胞；

B、体外培养单个核细胞：

先将M-199培养液加入装有细胞的试管混匀后，种于预先包被有纤维连接蛋白的培养瓶/皿中；放入常规细胞培养箱培养2小时后，取出培养皿中的悬浮液，将悬浮液离心，离心条件为4℃，300g，6分钟；离心后去上清液，将添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液加入试管后混匀，将混匀的细胞液二次接种于预先包被有纤维连接蛋白的培养瓶/皿中；放入常规细胞培养箱进行培养；每48-96小时给培养皿内的细胞更换为添加低浓度血清和生长因子的M-199培养液一次；培养7天后，所得的贴壁细胞即为EPC；

所述的添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液的配方为：M-199为基础培养液，20％胎牛血清，重组人EGF 10.0ng/ml，重组bFGF20.0ng/ml，vEGF2.0ng/ml，Long R3 IGF-140.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml；

所述的添加低浓度血清和生长因子的培养液的配方为：M-199为基础培养液，5％胎牛血清，重组人EGF 5.0ng/ml，重组人bFGF 10.0ng/ml，vEGF 0.5ng/ml，Long R3 IGF-120.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml；

C、体外消化传代扩增EPC；

D、内皮祖细胞鉴定：进行细胞形态学、表型和细胞功能鉴定。

2、根据权利要求1所述的一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于其中的步骤A，具体操作如下：

无菌条件下取小型猪髂骨抗凝骨髓5-10ml，将骨髓细胞移入试管和无菌PBS液1∶1混匀后离心，离心条件为20℃，400g，10分钟；离心后去上清液，再和无菌的PBS液1∶1混匀；取Ficoll液10ml分两份加入空白试管；将混匀的骨髓细胞液体缓慢的滴入装有Ficoll液的试管后离心，离心条件为20℃，900g，30分钟；离心后，先去除最上层的上清液，将单个核细胞层取出加入空白试管，再加入1∶1无菌PBS液混匀后离心，离心条件为4℃，500g，10分钟；离心后去上清液，再加入1∶1无菌PBS液混匀后再次离心，离心条件为4℃，300g，10分钟，所得的即为分离出的单个核细胞，并对分离出的单个核细胞进行计数。

3、根据权利要求1所述的一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于其中的步骤B中所述的单个核细胞种植密度为2×10⁵-5×10⁵个细胞/cm²。

4、根据权利要求1所述的一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于其中的步骤B中所述的纤维连接蛋白包被的浓度为25mg/l，密度为5-10μl/cm²，在4℃环境下，包被时间不少于12小时。

5、根据权利要求1所述的一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于其中的步骤C，具体操作如下：

原代细胞培养7天后，观察细胞，当贴壁细胞铺满整个培养皿的底壁，准备消化传代；先用PBS×2次洗去未贴壁的细胞，每次2分钟，贴壁细胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化计数后5×10³-1×10⁴个细胞/cm²的密度再分种于新皿中进行传代培养，记为P1；以后细胞每培养4d后，观察细胞，当贴壁细胞铺满整个培养皿的底壁，即消化传代；先用PBS×2次洗去未贴壁的细胞，每次2分钟，贴壁细胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化后5×10³-1×10⁴个细胞/cm²的密度再分种于新皿中进行传代培养，记为P2；以此类推。