[发明专利]一种重组人釉原蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白，尤其是涉及一种重组人釉原蛋白及其制备方法。

背景技术

釉基质蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)是牙齿发育到钟状期，由内釉上皮细胞分化而来的成釉细胞合成和分泌一系列细胞外基质蛋白。自1975年首次提出来自赫特威氏上皮根鞘的釉质相关蛋白可以诱导牙根部无细胞性牙骨质形成以后，体外实验和临床治疗广泛证实EMPs能有效促进牙周韧带、牙骨质、牙槽骨再生，形成类似正常的牙周组织的排列，达到真正的牙周再生。发育中EMPs最主要的成分——釉原蛋白(amelogenin，Am)，也是EMPs中促进牙周再生的主要活性成分。但Am的组成不是单一的，至少有9种成分，分子量范围5～27kD。目前广泛应用于牙周再生的基础研究和临床应用的EMPs基本为提取的猪釉基质蛋白，其主要的成分是分子量为20kD、13kD、11kD的Am。现有的唯一釉基质蛋白市售商品——的有效成分也是从猪牙胚组织中提取的釉原蛋白的衍生物。

目前国内尚未见有人工合成的单一组分的人Am。Am是成釉细胞中Am基因的表达产物。人有两个Am基因，一个定位于X染色体p22.1-p22.3区域，另一个在Y染色体q11处。逆转录PCR证实主要的转录本来自于X染色体。人Am基因至少包括7个外显子，存在至少有9种选择剪切的方式，编码的九种不同Am在组织中的含量并不相等。剪切去掉外显子4是最常见的一种剪切方式，由它编码的Am在发育的釉质中最多见。研究证实成熟的人Am的主要成分是X染色体上Am基因的翻译产物——由175个氨基酸残基组成的Mr1.96×10⁴蛋白。

发明内容

本发明的目的在于：

(1)提供一种重组人釉原蛋白；

(2)提供一种重组人釉原蛋白制备方法。

本发明的技术方案如下：

1、一种重组人釉原蛋白，通过下列方法制得：

a、克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；

b、构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm；

c、将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm转化表达菌株E.coli.Rosetta；

d、诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST-hAm；

e、通过GST亲和层析纯化融合蛋白。

在步骤a中克隆位点的两个内切酶EcoR I和Sal I作为将目的基因克隆入载体的内切酶。所述内切酶EcoR I和Sal I酶切位点的引物序列如下：Am-EcoR I 5’CCG GAA TTC ATG CCT CTA CCA CCT CAT CCT G3’；Am-Sal I 5’ACGC GTC GAC TTA ATC CAC TTC CTC CCG CTT G3’。步骤a所述的人釉原蛋白成熟肽基因由人X染色体编码，来源于人胚胎的乳牙牙胚组织，步骤b所述的重组原核表达质粒是将人釉原蛋白成熟肽编码序列插入原核表达质粒PGEX4T1而得到的，步骤c所用的是专门用于含有稀有密码子的真核蛋白在大肠杆菌中的表达宿主菌E.coli.Rosetta，步骤d所述的含有重组质粒的克隆表达菌株用异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导表达融合蛋白GST-hAm，步骤e所表达的融合蛋白通过GST亲和层析纯化。

2、一种重组人釉原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

a、克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；

b、构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm；

c、将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm转化表达菌株E.coli.Rosetta；

d、诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST-hAm；

e、通过GST亲和层析纯化融合蛋白。