[发明专利]一种双基因共表达质粒、其转化的工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种双基因共表达质粒、其转化的工程菌及其构建方法。

背景技术

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是神经氨酸苷酶抑制剂的前体，该抑制剂在临床上用于治疗病毒性流感，在医药领域中具有重要的应用价值。

获得Neu5Ac的方法虽然有多种，但由于生物转化法制备Neu5Ac具有工艺简单，纯化方便、污染少等优点，因此现在主要采用该方法制备。生物转化法生成Neu5Ac的过程分为一步酶法和两步酶法两种。其中一步酶法，即利用N-乙酰神经氨酸裂合酶催化N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸(pyruvate)直接生成Neu5Ac。该法步骤简单，转化效率及产率都比较理想，但ManNAc的昂贵的价格限制了这种方法的应用。两步酶法，即用N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶先将N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)转化生成ManNAc，再由N-乙酰神经氨酸裂合酶催化生成Neu5Ac，该过程详见图1。

1985年，Ohta等人公布了编码大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)N-乙酰神经氨酸裂合酶基因(nal)序列，并于1986年成功克隆了该基因。随后，Maru等人于1996年成功地从猪肾中克隆了N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因(age)。目前已有分别利用N-乙酰神经氨酸裂合酶基因nal和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因age构建的单独的表达质粒，但是由于两步酶法的生产过程相对复杂，因此有必要进一步加以改进。

发明内容

本发明的首要目的就在于对两步酶法生产N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的工艺进行改进，从而提供一种N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶的双基因共表达质粒。

本发明的第二个目的在于提供一种所述双基因共表达质粒的构建方法。

本发明的第三个目的在于提供一种利用所述双基因共表达质粒转化的基因工程菌。

本发明的第四个目的在于提供一种所述工程菌的构建方法。

本发明的第五个目的在于提供一种利用所述工程菌生产Neu5Ac的方法。

本发明的双基因共表达质粒同时含有N-乙酰神经氨酸裂合酶基因nal和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因age。

本发明分别利用质粒pLY-3、pET-29a-nal和pQE30-nal扩增得到N-乙酰神经氨酸裂合酶基因nal表达元件，然后在连接酶的作用下分别连接于含有N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因age表达元件的质粒pLY-AGE、pET-29a-age和pQE30-age，构建获得双基因共表达质粒。

将所述双基因共表达质粒转化大肠杆菌，获得可同时表达N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶的基因工程菌。

将所述工程菌在适当的条件下进行发酵，收集菌体破碎离心，获得的上清粗酶液可以将底物GlcNAc转化为Neu5Ac。

利用本发明的双基因共表达质粒构建的基因工程菌，能够同时表达N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶，从而可以实现在一次反应过程中，将GlcNAc催化生成Neu5Ac，大大简化了生产工艺过程，提高了生产效率和Neu5Ac的产率。

附图说明

图1是两步酶法制备Neu5Ac流程示意图。

图2是双基因共表达质粒pLY-NA结构示意图。

图3是双基因共表达质粒pLY-9结构示意图。

图4是双基因共表达质粒pLY-10结构示意图。

图5是构建重组质粒pLY-NA流程图，其中，5A为pLY-NAL亚克隆的制备流程图，5B为重组质粒pLY-NA的构建流程图。

图6是构建重组质粒pLY-9流程图，其中，6A为pLY-NAL-1亚克隆的制备流程图，6B为重组质粒pLY-9的构建流程图。

图7是构建重组质粒pLY-10流程图，其中，7A为pLY-NAL-2亚克隆的制备流程图，7B为重组质粒pLY-10的构建流程图。

图8是N-乙酰神经氨酸裂合酶基因nal的表达元件PCR扩增的电泳结果。

图9是pLY-NA质粒的酶切后电泳验证图片，其中，电泳条带1为pLY-NA质粒的SphI酶切结果，电泳条带2为对照(pLY-AGE)。

图10是E.coli BL21(DE3)(pLY-NA)菌破碎上清粗酶液电泳结果，其中电泳条带1为蛋白分子量标准，电泳条带2为粗酶上清，其中42Kda的是N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶，33Kda的是N-乙酰神经氨酸裂合酶。