[发明专利]一种双基因共表达质粒、其转化的工程菌及其构建方法无效
| 申请号： | 200810034359.5 | 申请日： | 2008-03-07 |
| 公开（公告）号： | CN101525627A | 公开（公告）日： | 2009-09-09 |
| 发明（设计）人： | 王立军;朱丽;陈代杰;戈梅;罗敏玉;魏维;潘广文;夏兴;王天骄 | 申请（专利权）人： | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司;浙江医药股份有限公司新昌制药厂 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/62;C12N15/52;C12N15/61;C12N1/21;C12P13/02;C12R1/19 |
| 代理公司： | 上海智信专利代理有限公司 | 代理人： | 缪利明 |
| 地址： | 201203上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基因 表达 质粒 转化 工程 及其 构建 方法 | ||
1、一种双基因共表达质粒，其特征在于，所述质粒包含N-乙酰神经氨酸裂合酶基因、N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因以及一种合适的表达载体。
2、如权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述表达载体选自pET30a、pET29a或pQE30。
3、如权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸裂合酶基因其序列如SEQ ID NO：1的1854-2747、SEQ ID NO：3的151-1044、或SEQ ID NO：4的1829-2722所示。
4、如权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因其序列如SEQ ID NO：1的179-1342、SEQ ID NO：3的1383-2546、或SEQ ID NO：4的182-1345所示。
5、如权利要求1-4中任一项所述的质粒，其特征在于，所述质粒序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
6、如权利要求1-5中任一项所述质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A)设计并合成合适的引物，进行PCR扩增并与合适载体连接，制备包含N-乙酰神经氨酸裂合酶基因的亚克隆质粒；
B)酶切包含N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因的质粒，获得N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因酶切片段；
C)用与B步骤中同样的酶，酶切A步骤获得的亚克隆质粒，获得质粒酶切片段；
D)连接步骤B和C获得的酶切片段。
7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体选自pET30a、pET29a或pQE30。
8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸裂合酶基因其序列如SEQ ID NO：1的1854-2747、SEQ ID NO：3的151-1044、或SEQ ID NO：4的1829-2722所示。
9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因其序列如SEQ ID NO：1的179-1342、SEQ ID NO：3的1383-2546、或SEQ ID NO：4的182-1345所示。
10、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质粒序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
11、如权利要求1-5中任一项所述的质粒转化获得的工程菌。
12、如权利要求11所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌菌株为大肠杆菌。
13、如权利要求11所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌经培养后表达N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶。
14、如权利要求11-13所述的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将权利要求1-6所述的双基因共表达质粒转化感受态细胞并在选择性培养基上培养；
B、挑选阳性转化子。
15、如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括将获得的阳性转化子进行扩增培养的步骤。
16、一种生产Neu5Ac的方法，其特征在于，将权利要求11-13所述的工程菌发酵培养获得的菌体破碎后离心，将离心上清加入GlcNAc反应液，催化生成Neu5Ac。
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