[发明专利]一株农杆菌及其用于制备左旋内酯化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株高选择性右旋内酯水解酶产生菌、培养发法以及利用该菌株制备左旋内酯化合物或相应手性羟基酸的应用。

技术背景

羟基酸是与氨基酸类似的天然产物，在生物体的生理活动中扮演着非常重要的作用。羟基酸及其衍生物也是许多药物合成的中间体。羟基酸通过简单的酸化处理就可以形成内酯，目前有关商业用途的光学纯的羟基酸或内酯的制备方法有许多报道，前人利用化学拆分的手段分离得到(R)-α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁内酯，即D-(-)-泛解酸内酯。D-泛解酸内酯，是制备D-泛酸钙和D-泛醇的重要合成中间体。D-泛酸钙(又称维生素B5)是重要的维生素之一，广泛用于医药、饲料和食品行业中。最近生物催化制备手性内酯或羟基酸的方法已经有不少报道，许多生物酶已被作为有潜力的催化剂应用于手性内酯合成或降解反应。合成或降解这些化合物的酶可能与这些内酯系列化合物的天然构型有着相互的关系。

Glnzer等(Enzyme Microb Technol，1988，10：689～690)使用脂肪酶对O-乙酰泛解酸内酯进行拆分，Adam等(Synthesis，1988，5：373～375)则使用腈水解酶制备了(-)-泛解酸内酯，也有报道(Appl.Microbiol，1974，27(1)：130～134；Enzyme Microb Technol，1987，9(7)：411～416；Agric Biol Chem，1987，51：289～290；Agric Biol Chem，1987，51：3011～3016；Tetrahedron：Asymmetry，1994，5(8)：1419～1423)尝试利用氧化还原酶通过不对称氧化还原反应制备(-)-泛解酸内酯；1994年日本京都大学Shimizu等(Appl.Microbiol.Biotechnol，1995，44：333～338)使用Fusarium oxysporum AKU3702催化拆分消旋泛解酸内酯；2002年我国江南大学孙志浩等人(Process Biochem，2002，38：545～549)使用Fusarium moniliforme SW-902酶法拆分泛解酸内酯，均得到光学纯度较高的D-(-)-泛解酸内酯。

一般来说，产内酯酶的微生物菌株分布比较广泛，有报道(J.Biotechnol，2001，92：187～194)称产D(-)-泛解酸内酯酶的微生物一般存在于丝状真菌中，而细菌则倾向于优先催化水解L(+)-泛解酸内酯。1987年Kamata(JP62294092，JP62294096)分别利用SporidiobolusJohnsonii和Rhodotorula minuta培养后离心收集的细胞泥，在水溶液中水解DL-泛解酸内酯，得到D-泛解酸内酯。1992年，Takero等(JP04234995)用Arthrobacter radiobacter IFO12664，在含有DL-泛解酸内酯的溶液中反应得到D-泛解酸内酯。2002年，Maria Kesseler等(Adv.Synth.Catal，2002，344(10)：1103-1110)从965株细菌和霉菌中筛选出一株新的L-泛解酸内酯水解酶Agrobacterium tumefaciens Lu681。它能专一性水解L(+)-泛解酸内酯为L(-)-泛解酸，所得D(+)-泛解酸内酯的对映体过量值(ee)超过95％。2002年，BASF公司在不同国家申请了相关的专利(CN1384880A，DE10029194，DE19952501，PL355487)，内容涉及具有L-泛解酸内酯水解活性的蛋白，以及编码这些蛋白的核酸、核酸构建体、载体、遗传改造的微生物，使得通过基因改造后的L-泛解酸内酯水解酶在pH 4～10范围内活力稳定，最佳pH 7.2～7.7，最适温度为70～75℃，EDTA不抑制其活性。然后利用分子改造后的L-泛解酸内酯水解酶催化外消旋的泛解酸内酯转化为L-泛解酸和D-泛解酸内酯的混合物。缺点是底物泛解酸内酯浓度较低，仅为30％(w/v)，到目前为止还未见工业化生产的报道。