[发明专利]采用槲皮素交联制备人工生物心脏瓣膜材料的方法

权利要求书

1.一种人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于采用猪主动脉脱细胞心脏瓣膜材料，经脱细胞和槲皮素交联制备而成，其具体步骤为：

(1)新宰杀的猪主动脉心脏瓣膜作为交联对象，用1-6℃平衡盐缓冲液D-Hanks液作为储存运输液，在4℃下、4小时内剪下瓣膜叶片，使用D-Hanks液清洗干净；

(2)在1-40℃下用脱细胞溶液以0-240转/分钟的转速摇动脱除瓣膜细胞12-96小时，清洗干净；使用DNA和RNA酶液37℃下120rpm转速摇动消化12-96小时，脱去细胞核，再次清洗干净；

(3)用超纯水配制的D-Hanks液，将脱细胞的心脏瓣膜材料在10-40℃下、120转/分钟的转速摇动清洗瓣膜细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸大分子12-96小时，最后再次用超纯水配制的D-Hanks液充分清洗干净；

(4)将步骤3所得到的脱细胞的心脏瓣膜材料浸入槲皮素溶液中交联；槲皮素用无水乙醇溶液或二甲亚砜溶液溶解后，再用D-Hanks液稀释配制成浓度为0.1-10mg/mL槲皮素溶液；心脏瓣膜材料在槲皮素溶液中10-40℃下、60-240rpm摇动交联1-96小时。交联结束后，取出瓣膜材料，用D-Hanks液充分清洗干净；

(5)将交联后的脱细胞心脏瓣膜材料浸入D-Hanks液中作后处理，15-40天后即可得到本发明的瓣膜材料，并将所制得的瓣膜材料保存于D-Hanks液中备用；

所述的D-Hanks液是无Ca、Mg离子的磷酸缓冲液，其配方是将0.4g KCl，0.06g KH₂PO₄，8.00g NaCl，0.35g NaHCO₃和0.09g Na₂HPO₄·7H₂O溶解于1L超纯水中而制成；

所述的脱细胞液有A、B两种，其中，脱细胞液A液可为以下三种溶液配方中的任意一种：

配方(1)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠；

配方(2)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.5％非离子去垢剂聚乙二醇辛基苯基醚、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA；

配方(3)含0.5％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA；

脱细胞液B液配方为D-Hanks液配制的20μg/ml的核酸酶和0.2mg/ml的脱氧核酸酶混合液。

用任一种A液37℃下持续摇动处理48小时，或4℃下处理72小时，初步脱去细胞。再用B液相同条件下进一步脱去细胞残余物。

2.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的脱除瓣膜细胞的方法为下述三种中的任一种：(A)1-4℃下不摇动脱除24-96小时；(B)常温25±5℃下60-240转/分钟的转速摇动脱除24-96小时；(C)或37±2℃下60-240转/分钟的转速摇动脱除24-96小时摇动脱除。

3.按权利要求2所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于方法A中脱除时间为48-120小时。

4.按权利要求2所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于方法B中摇动转速为120转/分钟，摇动脱除24-96小时。

5.按权利要求2所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于方法C中摇动转速为120转/分钟，摇动脱除24-72小时。

6.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的用超纯水配制的D-Hanks液清洗脱细胞心脏瓣膜材料的方法是指用电阻率为18.2MΩ超纯水配制的D-Hanks液，充分清洗脱细胞心脏瓣膜材料的细胞残渣、碎片及游离的蛋白质或核酸大分子。

7.根据权利要求1所述的人工生物心脏瓣膜材料的交联制备方法，其特征在于所述的用超纯水配制的D-Hanks液清洗脱细胞心脏瓣膜材料的方法的环境条件是：37℃、120rpm转速摇动清洗24-120小时，最后再次用超纯水配制的D-Hanks液清洗3次。