[发明专利]通过酶联免疫吸附方法检测小分子RNA芯片的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种通过酶联免疫吸附方法检测小分子RNA(miRNA)芯片的方法。

背景技术

近年来，microRNA作为调控基因的一个大类渐渐被人们所熟知。microRNA广泛的存在于多细胞生物中，并且在发育调节，细胞凋亡，细胞增殖，应急反应等诸多生物过程中起着重要的调节作用。面对种类繁多的miRNA，基因芯片凭借其微量、快速、大规模平行检测等优势，在miRNA的研究中发挥着越来越重要的作用。

目前检miRNA的技术主要采用miRNA表达谱检测技术，常用的研究方法是miRNA的克隆和Northern杂交。通过克隆特异生物样品的miRNA不但可以发现新的miRNA，而且miRNA被克隆的频率也反映其丰度。Northern杂交可以比克隆更为精确地反映miRNA表达谱，是研究miRNA表达谱的常规方法。但是，Northern杂交一次只能研究一种miRNA在不同组织或器官中的分布，而且不同miRNA的Northern杂交不可比较。Northern杂交和克隆的方法一样，都非常费时费力，而且还要应用放射性同位素标记。

寡核苷酸芯片技术是一种微量、快速、大规模平行检测mRNA表达谱的技术，它通过探针设计，使得其所有探针在同一杂交条件下可以特异性地与相应的mRNA结合。反应时总RNA或者带poly(A)的总mRNA通过荧光标记引物(oligo(T)或随机引物)或者反转录过程中掺入荧光标记的方法标记cDNA，然后与芯片杂交进行检测。只需要微量的样品，就可以平行的检测所有的microRNA在组织，细胞中的表达情况。然而miRNA表达谱的检测不同于mRNA表达谱的检测之处在于miRNA与mRNA相比太短，难以进行探针设计，而且序列上没有象mRNA一样的poly(A)尾巴，不能象mRNA一样可以用荧光标记的oligo(T)进行反转录标记。所以，荧光标记是miRNA芯片的一个难点。现有技术中所用的miRNA荧光标记方法各不相同，或者采用通过随机引物反转录标记miRNA的cDNA的方法，或者采用RT-PCR的方法标记miRNA正义链，或者采用直接标记miRNA的荧光标记方法。相应于标记的方法的不同，探针也有所不同。

综上可见，现有的miRNA芯片大多基于荧光标记技术，芯片的检测需要昂贵的荧光扫描仪，限制了miRNA芯片的广泛应用，尤其是在临床检测中的应用。因此本领域迫切需要开发简便有效且低成本的检测miRNA芯片的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种简便有效且低成本的检测miRNA芯片的方法。

在本发明的第一方面，提供一种检测RNA样品中待测miRNA的方法，所述方法包括：

(a)将RNA样品加样于miRNA芯片，所述miRNA芯片上固定有对应于(如与待测miRNA互补)待测miRNA的探针，所述RNA样品携带酶联免疫可检测信号；从而使得待测核酸样品中的miRNA与miRNA芯片上相应的探针结合，在芯片上形成“酶联免疫可检测信号-miRNA-探针”复合物；和

(b)利用酶联免疫法检测“酶联免疫可检测信号-miRNA-探针”复合物中的酶联免疫可检测信号，从而确定RNA样品中待测miRNA的存在与否以及存在的量。

在另一优选例中，所述的酶联免疫可检测信号是生物素或其类似物。

在另一优选例中，步骤(b)包括：

(b1)用所述酶联免疫可检测信号的偶联物与“酶联免疫可检测信号-miRNA-探针”复合物反应，所述酶联免疫可检测信号的偶联物是亲和素或其类似物，且该偶联物上携带酶标记物；从而在芯片上形成“酶标记物-偶联物-酶联免疫可检测信号-miRNA-探针”复合物；

(b2)利用所述酶标记物对应的底物与“酶标记物-偶联物-标记物-miRNA-探针”复合物反应，从而确定待检测样品中待测miRNA的存在与否以及存在的量。

在另一优选例中，所述的酶标记物选自(但不限于)：辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

在另一优选例中，所述的酶标记物对应的底物选自(但不限于)：用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)或5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)；或用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)或2，2’-连氮-双-〔3-乙基苯并噻唑啉磺酸〕(ABTS)。