[发明专利]重组蛋白的变复性方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及重组蛋白体外双变性复性工艺。

背景技术

外源蛋白在一些基因工程菌中表达量可高达细胞蛋白含量的50％，这种高表达往往会导致目标蛋白在体内形成不溶的聚集体即包涵体(Inclusion body，IB)。包涵体由于没有完全正确的天然态结构，不具有生物学活性，必须经过分离、体外复性、纯化等工艺才能变成有生物学功能的产品。因此从包涵体中提取纯化及复性重组蛋白的工艺引起高度重视，提取纯化及复性重组蛋白的工艺优劣直接影响产品的质量及效率，从而直接影响经济效益。

在重组蛋白提取纯化及复性工艺中，必须先用蛋白变性剂(溶解剂)将包涵体形式的重组蛋白变性溶解，以便进一步纯化除去杂质，这是关键技术之一。然后于适宜条件下进行复性，以重获天然活性。因此重组蛋白由变性到复性是其关键技术之二。上述两个关键技术主要影响产品的纯度及效率。目前已有技术对提取纯化蛋白存在以下问题：

1.重组蛋白在盐酸胍或尿素等变性剂中溶解度有限，在降低变性剂＜4mol/L时，重组蛋白通常不能与杂蛋白、核酸解离而被析出，严重影响产品回收率。

2.为了提高重组蛋白的纯度，采取先纯化后复性的工艺程序，然而，由于变性剂的浓度高，粘稠度大、用量也大，因而操作难度很大，成本高。

3.由于重组蛋白长时间与高浓度变性剂作用，导致变性剂及其产物对重组蛋白的共价修饰，致使重组蛋白复性率降低，产品收率随之降低。

鉴于已有技术存在上述问题。其结果是：工艺复杂操作难度大，产品的纯度及收率均低，进而导致成本高，不利于工业化生产。

因此，目前本领域还缺少一条工艺简单、产品的纯度及收率均高，而成本低的蛋白提取纯化工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一条工艺简单、产品的纯度及收率均高，且成本低的蛋白提取纯化方法。

因此，本发明提供一种从包涵体蛋白制备可溶性蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用第一变性剂溶液溶解包涵体蛋白，从变性液中提取纯化出经一次变性的蛋白；其中，所述的第一变性剂溶液含精氨酸(优选的为L-精氨酸)；

(b)对(a)获得的经一次变性的蛋白进行二次变性，获得含有经二次变性的蛋白的变性液；和

(c)对(b)获得的变性液进行复性，分离获得可溶性蛋白。

在另一优选例中，步骤(a)中，所述的从变性液中提取纯化出经一次变性的蛋白的方法是：

(a1)将变性液离心，取上清液；和

(a2)采用蛋白等电点沉淀法从(a1)获得的上清液中提取纯化出经一次变性的蛋白。

在另一优选例中，步骤(a2)中，所述的蛋白等电点沉淀法包括：

(i)将(a1)获得的上清调节至比蛋白等电点PH值高0.5-3(优选的为1-2)的PH值，离心取上清液；和

(ii)将(i)获得的上清液调节至蛋白等电点PH值±0.3的PH值，离心取沉淀，该沉淀即为纯化出的经一次变性的蛋白。

在另一优选例中，(ii)中，上清液调节至蛋白等电点PH值±0.2的PH值，最优选上清液调节至蛋白等电点PH值±0.1的PH值。所述的蛋白等电点是指目的蛋白的等电点。

在另一优选例中，所述的蛋白选自(但不限于)：绿色荧光蛋白，日本血吸虫弹性蛋白酶(SjE)，人HSPC067蛋白(HSPC067)，或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL))。

在另一优选例中，所述的第一变性剂溶液还含有：Triton。在优选实例中，所述的Triton是Triton-X-100。

在另一优选例中，所述的第一变性剂溶液含有：(0.5±0.2)mol/L精氨酸、(1±0.2)mmol/L EDTA，(1±0.8)％(v/v)Triton，和(50±20)mmol/L NaCl；更优选的，所述的第一变性剂溶液含有：(0.5±0.1)mol/L精氨酸、(1±0.2)mmol/L EDTA，(1±0.4)％(v/v)Triton，和(50±10)mmol/L NaCl。

在另一优选例中，所述的第一变性剂溶液还含有：β-巯基乙醇。较佳的，β-巯基乙醇的含量为(5±2)mmol/L。

在另一优选例中，所述的二次变性采用第二变性剂溶液，该溶液含有选自下组的成分：尿素，盐酸胍，十二烷基磺酸钠，或脱氧胆酸钠。

在另一优选例中，所述的第二变性剂溶液含有：尿素，EDTA，β-巯基乙醇，Tris-HCL，和NaCl。