[发明专利]用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种食品安全技术领域的方法，具体地说，是一种用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)与副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是四种重要的食源性致病菌是公知公开的菌种，它广泛分布于自然界，它们主要是通过食品(特别是动物性食品)传播、感染人体，直接造成人体健康损害。PCR(聚合酶链式反应)技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，现在已广泛应用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血弧菌的检测。但PCR方法在不同的实验室或检测部门所检测的目的基因和操作流程有一定的差异，没有形成标准，得到的检测结果也不尽相同。近年来的实践应用表明，食品和培养基中存在的抑制剂可影响PCR反应，使检测结果呈假阴性。尽管PCR方法在不断的改进和完善，却不能有效地阻止假阴性结果的发生。为了解决常规PCR方法中普遍存在的假阴性问题，近几年在PCR扩增体系中引入了扩增内标(IAC)。大多数学者认为在PCR体系中加入扩增内标能有效避免假阴性现象的出现，是PCR检测标准化的措施之一。制备IAC的方法有很多，根据不同的实验目的和要求采用不同的制备方法。初期的扩增内标是利用克隆技术将目标序列的PCR产物通过插入、删除或者替换等手段处理后制备的，制备方法较烦琐，且制备的扩增内标仅能用于单一微生物的检测。

经对现有技术的文献检索发现，Youne s Maaroufi等在《FEMS Immunol MedMicrobiol》(免疫医学微生物学)2006年第48期183-191页上发表的“Development of a multiple internal control for clinical diagnosticreal-time amplification assays”(一种运用于临床诊断荧光定量PCR体系的多重扩增内标)，该文中提出一种多重扩增内标(mIAC)的合成方法，方法为：通过重叠PCR技术将5种病毒的检测引物序列合成到一条核苷酸序列中构建多重扩增内标，通过一条多重扩增内标可用于5种病毒的检测。但无法用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血弧菌普通PCR检测。

发明内容

本发明的目的在于填补国内在多重扩增内标研究上的空白，提供一种用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法。本发明利用生物信息学的方法，根据金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物，根据这四对引物序列运用重叠PCR技术人工合成了一种多重扩增内标，可分别用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血弧菌的普通PCR检测，在确保检测准确性与高效性的同时大大降低检测成本，填补了国内在多重检测内标研究上的空白。

本发明通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：

第一步，利用生物信息学的方法，根据金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物；

第二步，采用重叠PCR技术将金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特异性检测引物序列拼接成一条核苷酸片段，构建多重扩增内标；

第三步，采用分子生物学技术将该人工序列克隆到质粒载体pMD-18T，构建含多重扩增内标序列的质粒pMD-mIAC；

第四步，多重扩增内标分别在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血弧菌检测中的验证。

所述的特异性检测引物，是指：四对分别用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌PCR检测的检测引物(vicKF/vicKR、invAF/invAR、toxRF/toxRR、hlyAF/hlyAR)，进行PCR检测时，上述引物能扩增到金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌菌株特有的检测基因，或者是PCR体系中添加的扩增内标。

所述的重叠PCR技术，是指：采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。