[发明专利]用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法

权利要求书

1.一种用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，利用生物信息学的方法，根据金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物；

第二步，采用重叠PCR技术将金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特异性检测引物序列拼接成一条核苷酸片段，构建多重扩增内标；

第三步，采用分子生物学技术将该人工序列克隆到质粒载体pMD-18T，构建含多重扩增内标序列的质粒pMD-mIAC；

第四步，多重扩增内标分别在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血弧菌检测中的验证。

2.根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的特异性检测引物，是指：四对分别用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌PCR检测的检测引物vicKF/vicKR、invAF/invAR、toxRF/toxRR、hlyAF/hlyAR，进行PCR检测时，上述引物能扩增到金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌菌株特有的检测基因，或者是PCR体系中添加的扩增内标。

3.根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的重叠PCR技术，是指：采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

4.根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的多重扩增内标，是指：人工合成DNA片段，该片段是通过重叠PCR技术人工合成的，其中包含金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血弧菌的特异检测引物序列，在确保扩增效率的同时减少了非目标菌的DNA对PCR检测的干扰。

5.根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的分子生物学技术，具体如下：采用转基因方法转移上述带有扩增内标的载体到大肠杆菌E.coliTG-1中，然后涂布于选择性平板上，经37℃培养12h，用灭菌的牙签从选择性平板上挑取白色菌落，接菌到装有5ml LB培养液的PA瓶中，再在37℃下以150r/min摇床培养8h，提取质粒pMD-mIAC，经PCR扩增后，确定获得转化子。

6.根据权利要求5所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的选择性平板，是指90mm选择性平板，其中含有100mg/ml氨苄青霉素10μl，20％的IPTG溶液7μl，2％的X-gal溶液40μl。

7.根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的载体，其转化的宿主细胞，是大肠杆菌，其中包含有扩增内标的DNA片段。

8.根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的多重扩增内标的验证，是指：通过将含多重扩增内标的质粒pMD-mIAC添加到普通PCR反应体系中，用相应检测引物与目的基因同时进行扩增，多重扩增内标与目的基因可扩增出大小不同的DNA片段，当样品中含有的目的基因时，电泳结果中含有目的基因和多重扩增内标的扩增片段，检测结果呈阳性；当样品中不含目的基因时，电泳结果中只有扩增内标的扩增片段，检测结果为阴性；当电泳结果中不含有任何扩增片段时，检测结果即为假阴性。

9.根据权利要求8所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的假阴性，是指PCR反应受到了食品或培养基等物质中存在的抑制剂的影响而没有发生反应，或者是由于操作人员的操作失误导致结果呈现阴性。

10.根据权利要求8所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的目的基因，是指：金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因。