[发明专利]山楂叶中单体化合物的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从山楂叶中分离纯化高纯度的单体化合物4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法。

背景技术

山楂为蔷薇科(Rosaceae)山楂属(Crataegus.L)植物，分布于北温带，在我国东北、华北和广东、广西、福建等地都有种植，其叶最早在东晋时代就有入药的记载。药理及临床实验表明：山楂叶中黄酮类化合物对心血管系统具有降压、降血脂、增加冠脉流量、改善血液流变等功效，对心肌缺血、心律失常等心血管疾病均有较好疗效。其中4-O-鼠李糖芦丁(4-O-rhamnosylrutin)、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷(2″-O-rhamnosylvitexin)和″-O-葡萄糖牡荆素(4″-O-glucosylvitexin)是山楂叶中的主要活性成分(Rayyan S，et al.Phytochem.Anal.2005，16：334；Dong YJ，et al.J Shenyang Pharm Univ.1996，13(1)：31；BeckMA，et al.Phytochemistry.1999，50：329.)，它们的结构式如下：

4-O-鼠李糖芦丁

牡荆素-2″-O-鼠李糖苷

4″-O-葡萄糖牡荆素

目前，国内外多采用柱色谱法和重结晶等传统方法分离纯化山楂叶中的有效单体，这类方法或需使用有毒有机溶剂，如硅胶柱层析使用氯仿、甲醇，会造成环境污染；或成本高且操作繁琐，如聚酰胺填料，耗时费力(Zhang PC，et al.Phytochemistry.2001，57：1249；Svedstron U，et al.Phytochemistry.2002，60：821)，而且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用。另外，由于山楂叶中各主要成分极性极为相近，通常无法在较短时间内使目标化合物得到有效的分离导致所得产品纯度不高，需借助多次重复制备进行纯化而造成目标化合物损失较多。

高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，因而样品回收率高，同时还具有应用范围广、仪器操作简单、分离量大等优点。此外，高速逆流色谱技术由于其分离机理不同于传统的高效液相色谱技术，常作为HPLC的一种强有力的补充技术广泛应用于天然产物的分离及纯化。但目前国内外还未见有将高速逆流色谱应用于山楂叶中单体化合物的分离纯化。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备工艺简单快速、回收率高、纯度高且适于工业化生产的，从山楂叶中分离纯化单体化合物4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法。

山楂叶中主要活性成分为中等极性黄酮类成分，其中大多结构十分相近，传统的制备液相色谱技术无法在较短的时间内使各极性相近的黄酮类化合物获得有效的分离。本发明采用高速逆流色谱技术与传统的制备液相技术相结合，利用两者的不同分离机理将目标化合物4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素与其他极性相近的干扰成分分离，从而获得高纯度的目标化合物。

本发明提供一种从山楂叶中分离纯化单体化合物4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法，包括如下步骤：

1.制备山楂叶粗提物：

按常规将干燥山楂叶粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，过滤，将滤液减压浓缩至无醇味，得山楂叶粗提液；

2.纯化：

(1)用大孔吸附树脂纯化：将上述制得的山楂叶粗提液加适量水混悬后，过大孔吸附树脂柱，先分别用水和5％～15％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用20％～30％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物，经高效液相色谱(HPLC)检测，含有90％以上4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素，得率为3％～5％；