[发明专利]用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋 白及用该L1蛋白制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒 亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接 触传播，引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被 列为性传播疾病。1995年，国际癌症研究中心公布的研究结果证实，HPV 与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见，HPV感染已成为严重危害人类健康 的病原体。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和HPV 感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。

根据HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将HPV分为低危型和高 危型。HPV 6、11、34、40、42等型别多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫 颈上皮轻度不典型性增生病变中，属HPV低危型；而宫颈上皮重度不典型 增生及宫颈癌中以HPV 16、18、31、33、35、39、45型感染更为多见，这些 亚型为高危型。不同人群中一系列的研究已证实生殖道的HPV 16、18型感 染与宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。因此HPV 16、18型 的疫苗的开发将能够有效的预防宫颈癌的发生。

HPV是一种DNA病毒，直径约为45～55nm，呈球形，无包膜，衣壳 为由72个壳微粒组成对称偏斜的20面体。其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白 (L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。主要衣壳蛋白L1在细胞中表达后能自 动组装成衣壳颗粒，称为病毒样颗粒(VLPs)，该颗粒与天然病毒有相似的 空间构象、免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化，因而基于 L1衣壳蛋白的VLP预防性疫苗的开发成为目前HPV疫苗研究的主要方向。

目前，Merck公司的预防型HPV四价疫苗(商品名Gardasil)已经上市。 该疫苗为酿酒酵母系统表达的HPV 16+18+6+11 L1蛋白，临床实验表明： Merck疫苗在预防16型、18型、6型(6a和6b)、11型HPV感染的有效率 接近100％。GlaxoSmithKline公司的预防型HPV双价疫苗(商品名为 Cervarix，昆虫细胞表达的HPV16+18L1蛋白)也已经进入FDA审批阶段， 已获准在澳大利亚、欧盟、菲律宾、阿联酋等地上市。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统具有操作简单、易于培养、表达量 高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译 后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母分泌效 率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。毕赤酵母中加到外源蛋 白每条侧链的平均长度为8～14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均 50～150甘露糖残基要短得多。

专利CN1869215A公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备人乳头瘤病 毒的病毒样颗粒的方法，分别将用PCR扩增宫颈癌病理组织标本得到的编 码人乳头瘤病毒晚期蛋白的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组 毕赤酵母细胞；利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达 L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒，但该文 献未公开该根据毕赤酵母密码子的偏爱性合成的HPV L1基因的核苷酸序列 以及重组L1蛋白的活性。

发明内容

因此，本发明要解决的问题就是提供一种表达量高的用毕赤酵母表达系 统制备重组人乳头瘤病毒18型L1(HPV 18 L1)蛋白的方法。本发明还要 解决的问题是提供用所述重组HPV 18 L1蛋白制备抗HPV 18感染的疫苗的 方法，制得的疫苗具有较佳活性。

本发明人经过深入而广泛的研究，成功的建立了用优化密码子的基因在 毕赤酵母表达系统中高量表达病毒样颗粒和制备抗人乳头瘤病毒18型疫苗 的技术，在此基础上完成了本发明。

首先，本发明人经过仔细的研究，设计了适用毕赤酵母偏好密码子的人 乳头瘤病毒18型基因的核苷酸序列。