[发明专利]一种培养筛选微生物菌种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌种的筛选方法，具体是对极端环境样品中微生物菌种的筛选分离培养方法。

背景技术

微生物特别是极端环境(如酸/碱/温/冷/盐样品、深海样品、火山口样品、高海拔样品、太空样品等)中的微生物，在自然生物、地球化学循环等方面扮演着极为重要的角色。研究极端环境微生物不仅有助于我们了解和认识生命起源与生命进化，极端环境的耐受机制以及其与环境之间的相互作用等；而且其基因资源、酶资源及其代谢产物资源产业被称为21世纪可持续发展的朝阳产业。微生物菌种资源，特别是具有特殊价值的菌种资源的争夺已成为当今国际生物资源争夺的一个重要组成部分。

微生物种类繁多、分布极为广泛，但目前受技术的限制，超过99％的微生物是未知的，或在当前认识水平或试验条件下是“不可培养的”。为此，研究建立新的微生物培养与选育方法，突破传统微生物培养方法的制约，以获得更多的微生物的种类，是当今微生物工作者迫切需要解决的问题。近年来，微生物分子生态学技术、宏基因组技术、生物信息技术、地球化学物质循环分析相关技术及多学科强交叉学科平台的形成等，这些为建立新的微生物培养与选育方法提供了强力的支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种从各类样品中筛选所含微生物菌种的方法，即通过建立样品中各类微生物的个性化富集培养体系，来富集分离样品中的微生物菌种。

本发明微生物菌种培养筛选方法的详细技术方案包括以下步骤：

1)样品处理及DNA抽提：溶解洗涤样品，收集菌体颗粒物质，去杂质，收集沉淀物；酚-氯仿-异戊醇抽提沉淀物中的DNA；

2)PCR扩增，克隆、酶切、测序及序列分析，检测样品中微生物种类多样性：分别采用细菌、古细菌和真菌通用引物扩增DNA抽提物，扩增产物经凝胶电泳检测后用凝胶回收试剂盒纯化，纯化产物连接克隆后通过蓝白筛选阳性克隆子；再对阳性克隆子进行克隆序列的扩增，扩增产物经酶切电泳后初步判断样品中所含微生物的种类数；对各种类进行测序分析，获知样品中的微生物种类、丰度、生物多样性和分布规律；

3)微生物菌种的个性化富集培养：用扫描电镜分析样品的表面形态结构；用能谱仪、X-射线采集样品矿物元素的成份及其有机物种类的信息；采集样品所在的环境信息，包括温度、酸碱度、盐度等；通过序列比对分析，初步判断各类微生物的种属及生长特征情况，参照已有的该类微生物的相关信息；对于新种则参照与之在系统发育树中亲缘关系最近的微生物的生长环境特点等信息；根据上述信息建立个性化富集培养体系；应用个性化富集培养体系富集各类微生物，分离纯化各富集分离物，获得纯培养物。

在本发明的步骤1)中，抽提沉淀物中的DNA的步骤具体为：

①向沉淀物中加入高浓度细胞裂解液，充分混匀，放入沸水浴中8～15min；

②55～65℃水浴30min以上；

③随后72℃水浴30min以上；

④加入酚/氯仿/异戊醇混和液，混匀，在室温下静置10min左右，离心，将上清液用酚/氯仿/异戊醇重复抽提，收集上清液；

⑤上清液用-20℃～4℃的无水乙醇沉淀，沉淀温度为4℃，沉淀时间30min以上，离心收集沉淀；

⑥用浓度为70％的乙醇洗涤沉淀物两次；

⑦沉淀物置于室温或真空干燥，用TE或无菌去离子水溶解沉淀，即得到基因组DNA提取液。

上述细胞裂解液包括以下各组分：0.10～0.30mol/L的EDTA；0.005～0.15mol/L的Tris·HCl；0.10～0.30mol/L的NaCl水溶液；质量百分浓度为2％～7.5％的SDS；质量百分比浓度为0.30％～0.75％的CTAB。

本发明区别于传统的选择性筛选培养、富集培养等方法，其优点是先用分子生态相关技术检测样品中所含微生物的种类、丰度等特征信息；再根据各种属的生长代谢特征、该菌所在样品的生长环境特点(如温度、酸碱度、盐度和物质组成等)等系列信息建立分别适合各微生物生长的个性化富集培养体系，有的放矢的富集与选育样品中特定的微生物。采用该方法能使得更多的“不能培养的微生物”变成可培养的。本方法克服了在分离培养样品中微生物种类的过程中，存在的效率低、损失新种的概率大、样品耗量大、随机性与盲目性程度高等问题，针对各类样品特别是珍稀样品，能分离培养出更多的微生物种类，从而提高了从样品培养和选育微生物的产率和种类数。

附图说明

图1：实施例中沉积物矿物元素的能谱图；