[发明专利]一种培养筛选微生物菌种的方法

权利要求书

1.一种培养筛选微生物菌种的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)样品处理及DNA抽提：溶解洗涤样品，收集菌体颗粒物质，去杂质，收集沉淀物；酚-氯仿-异戊醇抽提沉淀物中的DNA；

2)PCR扩增，克隆、酶切、测序及序列分析，检测样品中微生物种类多样性：分别采用细菌、古细菌和真菌通用引物扩增DNA抽提物，扩增产物，纯化，纯化产物连接克隆后通过蓝白筛选阳性克隆子；对阳性克隆子进行克隆序列的扩增，扩增产物经酶切电泳后初步判断样品中所含微生物的种类数；对各种类进行测序分析，获知样品中的微生物种类、丰度、生物多样性和分布规律；

3)微生物菌种的个性化富集培养：用扫描电镜分析样品的表面形态结构；用能谱仪、X-射线采集样品矿物元素的成份及其有机物种类的信息；采集样品所在的环境信息，包括温度、酸碱度、盐度等；通过序列比对分析，初步判断各类微生物的种属及生长特征情况，参照已有的该类微生物的相关信息；对于新种则参照与之在系统发育树中亲缘关系最近的微生物的生长环境信息；根据上述信息建立个性化富集培养体系；应用个性化富集培养体系富集各类微生物，分离纯化各富集分离物，获得纯培养物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中抽提沉淀物中的DNA的过程为：

①向沉淀物中加入高浓度细胞裂解液，充分混匀，放入沸水浴中8～15min；

②55～65℃水浴30min以上；

③随后72℃水浴30min以上；

④加入酚/氯仿/异戊醇混和液，混匀，在室温下静置10min左右，离心，将上清液用酚/氯仿/异戊醇重复抽提，收集上清液；

⑤上清液用-20℃～4℃的无水乙醇沉淀，沉淀温度为4℃，沉淀时间30min以上，离心收集沉淀；

⑥用浓度为70％的乙醇洗涤沉淀物两次；

⑦沉淀物置于室温或真空干燥，用TE或无菌去离子水溶解沉淀，得到基因组DNA提取液。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述细胞裂解液各组分的浓度分别为：EDTA：0.10～0.30mol/L；Tris·HCl：0.005～0.15mol/L；NaCl：0.10～0.30mol/L；SDS的质量百分浓度为：2％～7.5％；CTAB质量百分比浓度为：0.30％～0.75％。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述细胞裂解液的组成为：pH8.0，1mol/L的Tris·HCl、pH8.0，0.5mol/L的EDTA、5mol/L的NaCl水溶液、质量百分比浓度为20％的SDS，质量百分比浓度为10％的CTAB，各组分的体积百分比为12.5∶50∶5∶25∶7.5。