[发明专利]抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA，具体涉及一种抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA及其在筛选弓形虫减毒活疫苗中的应用。

背景技术

弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫，生活史复杂，涉及的组织器官多，可引起人兽共患的弓形虫病，其危害严重程度在再现疾病中仅次于结核。孕妇感染弓形虫可引起流产、早产、畸胎、死胎、婴幼儿先天性弓形虫病、小儿智力障碍等，对人口素质和优生优育产生严重影响。近年来，随着宠物热的兴起，人与动物接触机会增加，给弓形虫病的流行带来了新的问题。弓形虫脑炎已成为艾滋病患者的主要死亡原因之一，也是器官移植患者死亡和精神病发病的主要原因之一。

目前，尚无十分理想的弓形虫病治疗药物，现有的化学药物有治疗周期长、药物毒副作用大、不能根治等缺陷，迄今为止尚无一种药物能够杀灭包囊内的虫体，加之弓形虫的重复感染十分迅速，故虽经多方面努力仍未得以很好地遏制。因此，研制安全高效的弓形虫病疫苗已成为人们的迫切需要。

关于弓形虫减毒或弱毒活疫苗已有不少报道，主要有Ts温度敏感株、T263突变株、S48速殖子等，其中Ts温度敏感株在多种动物体内获得了抗致死性攻击的保护力；T263突变株能有效抑制猫排卵囊的能力，由此切断传播途径；1988年，O’connel用S48速殖子有效地控制了绵羊的流产，现已用作抗绵羊弓形虫病的商用疫苗。

本发明人通过具有保护性的抗弓形虫单克隆抗体免疫筛选弓形虫cDNA文库获得二个新的具有免疫保护性的候选分子，其中wx2基因(GenBank登录号为AY238892)序列长1515bp(SEQ ID NO.1)，起始密码子位于734-736位碱基，编码183个氨基酸，蛋白质理论分析量为48.639kDa。wx基因(GenBank登录号AY208994)序列长984bp(SEQID NO.2)，起始密码子位于243-245碱基，编码198个氨基酸，蛋白质理论分子量为49.165kDa。

我们利用近几年迅速发展起来的RNAi(RNA interfetense)新技术，针对弓形虫wx2基因的228-247位序列设计的双链DNA，并将其导入弓形虫体内，获得体内能持续表达siRNA分子的RNA干扰虫株，动物感染实验表明其毒力显著减低，有望开发出家畜和宠物用弱毒或减毒活疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA。

本发明的抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA是通过设计并体外合成双链DNA，构建逆病毒表达载体并导入弓形虫体内，获得在体内持续表达的siRNA分子。

所述双链DNA的碱基序列为：

正义链：

5′-GATCCCCCATCCGTAAAGCGGTGAGTACTCACCGCTTTACGGATGTTTTTA-3′；(SEQ ID NO.5)

反义链：

5′-AGCTTAAAAACATCCGTAAAGCGGTGAGTACTCACCGCTTTACGGATGGGG-3′；(SEQ ID NO.6)

其干扰位点为wx2序列的895～913位的19个核苷酸，方框内为为回文结构。

所述siRNA的表达质粒为逆病毒表达载体pSUPER.retro，其分子大小为7196bp。

本发明的另一目的在于提供上述siRNA在筛选弓形虫弱毒或减毒活疫苗中的应用。

应用本发明的siRNA筛选弓形虫弱毒或减毒活疫苗的技术方案如下：

首先构建干扰质粒，经电穿孔法导入弓形虫体内，经筛选获得体内能持续表达siRNA分子的可遗传的RNA干扰虫株，采用RT-PCR鉴定其干扰效果，选取高效的RNA干扰虫株，通过动物攻击实验检验其干扰效果，进而利用筛选到的干扰虫株开发家畜和宠物用弱毒或减毒活疫苗。

所述干扰虫株的筛选方法为：干扰虫株的筛选方法为：采用细胞内筛选和细胞外低温筛选结合的方法，首先在3μg/ml嘌呤霉素条件下、于L929细胞内培养8天，转到4μg/ml嘌呤霉素条件下、于4℃细胞外选择8天，然后在4μg/ml嘌呤霉素条件下、于L929细胞内选择培养5天。

本发明的优势在于：