[发明专利]副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测试剂与使用方法，具体涉及一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法。

背景技术

副溶血性弧菌是一种嗜盐性细菌。人由于生吃或食用未煮熟的海产品常引起食源性感染，导致急性胃肠炎。因此，需要建立一种安全可靠、简便快速的检测方法来保证食品的安全。常规检测副溶血性弧菌的方法大多要经过增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病学溯源，费时而且费力，已经不能满足食品生产的控制要求。

近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测副溶血弧菌，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(4～8h)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR检测方法。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1h左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification ofDNA，Nucleic Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63.。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5h进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：1.特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2.需要对细胞或组织破碎以提取DNA或RNA，不能够直接对细胞或组织中的病毒或基因进行定位；3.为了满足扩增所需要的DNA量，必须增殖病原菌的数量；4.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法。

为达到本发明的目的，采用以下技术方案：

按下列配方制备副溶血弧菌等温基因扩增快速检测试剂盒：

①引物混合液：混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，，引物序列如下：

外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；

外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；

内引物1：cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；

内引物2：ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；

②Bst DNA聚合酶(嗜热脂肪芽胞杆菌DNA酶大片段)：浓度为8U/μl；

③蛋白酶K：浓度为0.1-0.2μg/ml；

④RNA酶：浓度为0.4-0.6mg/ml；

⑤溶菌酶溶液：浓度为0.2-0.4mg/ml；

⑥样品预处理液：pH 7.0-9.0、100mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，50mM EDTA(乙二胺四乙酸)；