[发明专利]副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法

权利要求书

1、一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括：

①引物混合液：混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，，引物序列如下：

外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；

外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；

内引物1：cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；

内引物2：ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；

②Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；

③蛋白酶K：浓度为0.1-0.2μg/ml；

④RNA酶：浓度为0.4-0.6mg/ml；

⑤溶菌酶溶液：浓度为0.2-0.4mg/ml；

⑥样品预处理液：pH 7.0-9.0、100mM Tris-HCl，50mM EDTA；

⑦LAMP反应缓冲液：10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mM MgSO₄∶5mMBetina＝8∶5∶2∶10体积；

⑧磷酸缓冲液；

⑨通透性处理试剂1：为3-5％质量的多聚甲醛；

⑩通透性处理试剂2：为0.02-0.04％质量的多聚赖氨酸；

系列浓度乙醇溶液：为30-60％体积乙醇、60-80％体积乙醇、80-100％体积乙醇；

复染剂：荧光染料1-2mg/ml DAPI；

阳性对照副溶血弧菌基因组DNA。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的磷酸缓冲液组分为：137mM NaCl，2.7mMKCl，8.1mM Na₂HPO₄，1.5mM KH₂PO₄。

3、权利要求1或2所述的试剂盒检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)被检样品的预处理：将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清；离心，沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3-5％多聚甲醛固定；细胞悬浮液10-40μl滴加到用0.02-0.04％多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，风干；

(2)细胞壁通透性处理：将固定好的细胞分别置于30-60％，60-80％，80-100％浓度的乙醇液中各处理1-3min，进行脱水；用0.2-0.4mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞8-12min；其中溶菌酶用样品预处理液溶解；然后用0.1-0.2μg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2-5min，最后用0.4-0.6mg/ml的RNA酶处理12-17min；

(3)环介导等温扩增反应；在50-200μlPCR管配置反应体系：加入3-12μl引物混合液，反应缓冲液4.75-19μl，Bst DNA聚合酶0.25-1μl，模板DNA1-4μl，加水至12.5-50μl；将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应1-2h；

所用阳性对照：副溶血弧菌基因组DNA；

(4)反应结束后，将玻片置于1-2mg/mlDAPI染料中染色5-10min，无菌水中漂洗，自然干；

(5)将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果；

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)所述的恒温反应温度在63-65℃范围。

5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的多聚甲醛固定时间为8-12h。

6、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心取上清液的转速为1000-2000rpm，时间为1-2min。

7、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的转速为10000-15000rpm，时间为1-3min。

8、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)所述的漂洗次数为2次，每次12-15min。