[发明专利]一种克百威的酶联免疫检测方法和试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种检测克百威残留的双功能基因工程抗体免疫检测方法和实现所述方法的试剂盒以及试剂盒的制备方法。

背景技术

克百威(carbofuran，化学名2，3二氢-2，2二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯)，商品名呋喃丹，自1969年由FMC公司和Mobay化学公司开发生产后即作为一种高效、广谱的杀虫剂，广泛应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。克百威是一种胆碱酯酶抑制剂，对人和野生动物具有很高的毒性(小鼠经口LD₅₀为8mg/kg)，是蔬菜农药残留规定中不得检出的一种，但由于杀虫效果较好，目前在粮食和蔬菜上存在不合理使用的现象比较严重，对公众健康具有较大的危害。另外，克百威在酸性土壤中不易降解，极易污染土壤和地下水源，容易造成环境污染。因此，除加强克百威的使用管理，从源头控制的同时，还应加强对其的检测与监管，防止其进入食物链中。

目前，检测克百威残留的常规方法有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)，这些方法虽然灵敏精确，但需要昂贵的专业仪器，分析费时，成本较高。而酶联免疫分析(ELISA)快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法。

酶联免疫分析技术的基本原理就是利用酶标记的抗原或抗体之间的反应，通过酶作用底物的显色以对抗体或抗原进行分析。显然，在对抗原分子检测时，抗体本身以及酶标抗体的质量是保证该检测手段实施的关键。在以往对克百威的免疫法检测中，采用的是多克隆抗体或单克隆抗体。多抗较易获得但特异性不高，有研究者已报道抗克百威多克隆抗体中因存在不同IgG亚型，从而对克百威及载体蛋白BSA表现出不同的绑定能力。而单克隆抗体则不存在该问题，但值得注意的是，采用杂交瘤细胞培养进行单克隆抗体(McAb)周期长、产量低(产量平均只有10～100mg/L)。另外，无论是多克隆抗体还是单克隆抗体，在采用酶联免疫分析时都要对其进行酶的体外标记过程，将不可避免地存在以下缺点：1)化学共价交联过程对酶和抗体造成一定的变性，从而影响活性；2)酶标抗体批次产物的不均一性导致在使用前需对其进行校正；3)酶与抗体偶联前后产物都需要进行纯化，步骤繁琐。目前，我国自行生产的ELISA试剂盒在灵敏度及数量上都无法满足实际需要，仅深圳市每年进口克百威ELISA试剂盒一项费用达几百万元。由于试剂盒价格高，每个样品检测成本在几十元以上。因此，建立有效、实际的抗体及酶标抗体获得方法是进一步实现克百威快速检测需要解决的核心问题。

重组抗体技术引发了免疫检测技术的革命，尤其是噬菌体表面呈现技术的出现，使获得具有理想抗原亲和性及特异性的基因工程抗体成为可能。其优点在于能够将全套抗体可变区基因组装到表达载体内形成噬菌体抗体库，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，极为有效地从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体的可变区基因，便于进一步的基因操作。基于此的双功能基因工程抗体，就是指在DNA水平上把一种抗体片段的基因与其他功能分子如酶等的基因片段通过重组进行融合表达的抗体分子复合蛋白。该抗体不仅具有基因工程抗体分子量小，特异性高的特点，而且保持了酶特异性结合底物的活性；更值得注意的是，双功能基因工程抗体能够在各种表达系统中表达，并且可通过基因工程技术进行大量生产，对培养基无特殊要求，发酵密度高、发酵周期短、操作简便，整体费用较低，这就为双功能基因工程抗体在各相关领域中的实际应用从根本上提供了保障。但目前尚没有见到利用上述方法进行克百威检测的相关报道。

因此，本申请人在申请号为200610122594.9的专利申请中公开了一种检测克百威的酶联免疫分析方法，但并没有应用双功能基因工程抗体技术，本申请人期望利用噬菌体表面呈现技术获得抗克百威抗体基因，通过重组构建抗克百威双功能基因工程抗体表达载体，采用分子生物学、细胞生物学与生物分离相结合的方法，实现抗克百威双功能基因工程抗体在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化，并将其替代体外酶标多克隆/单克隆抗体用于酶免疫法分析克百威。本发明的检测方法为酶免疫检测技术进一步应用于小分子农、兽药残留的快速检测提供一种新途径，如果能进一步基于本发明所述克百威检测方法制备得到相应的检测用试剂盒，将具有重要的应用意义。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种高特异性、高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量快速检测克百威的双功能基因工程抗体免疫检测方法。