[发明专利]一种克百威的酶联免疫检测方法和试剂盒及其制备方法

权利要求书

1、一种克百威的酶联免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将克百威抗原包被于固相载体上；

(2)加入标样或待测样品，再加入克百威双功能基因工程抗体反应；

(3)加入底物液进行显色加以测定百分吸光度值；根据标准曲线，和待检样品的百分吸光度值，推算出待测样品中克百威的浓度。

2、根据权利要求1所述克百威的酶联免疫检测方法，其特征在于步骤(1)所述固相载体为酶标板，包被有能与克百威双功能基因工程抗体特异结合的克百威抗原，并封闭微孔表面未吸附位点；步骤(2)所述克百威双功能基因工程抗体为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶克百威双功能基因工程抗体，基因工程抗体为Fab、Fv、ScFv或单域抗体。

3、根据权利要求1或2所述克百威的酶联免疫检测方法，其特征在于当酶为辣根过氧化物酶时，所述底物液为含有3，3，5，5-四甲基联苯胺或邻苯二胺的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液、底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液、所述终止液为1～2mol/L硫酸溶液；当酶为碱性磷酸酯酶时，底物液为pH9.8的4-硝基酚磷酸钠盐(PNPP)二乙醇胺溶液、终止液为2mol/L的氢氧化钠溶液。

4、一种实现权利要求1所述克百威的酶联免疫检测方法的试剂盒，其特征在于由以下部分组成：

(1)试剂盒盒体；

(2)包被克百威抗原的酶标板，1块；

(3)克百威双功能基因工程抗体工作液，1瓶；

(4)克百威标准品溶液，共6瓶；

(5)底物液，1瓶；

(6)底物缓冲液，1瓶；

(7)终止液，1瓶；

(8)浓缩洗涤液，1瓶；

(9)使用说明书，1份；

(10)盖板膜，2张；

(11)含干燥剂的自封袋，1个。

5、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述盒体为硬纸盒；所述酶标板是96孔或40孔的聚苯乙烯酶标板，放于铝铂袋内；所述盖板膜采用不透明塑料贴纸；标准溶液、克百威双功能基因工程抗体、底物液、底物缓冲液、终止液和浓缩洗涤液分别采用不同颜色盖的透明塑料瓶分装；所述试剂盒盒内设有内垫，内垫设下凹瓶位，采用塑料泡沫材料。

6、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液为含0.5～1.5％吐温20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH值为7.4，浓度为0.1mol/L；所述6瓶克百威标准品溶液浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L和8.1μg/L；所述6瓶克百威标准品溶液每瓶1mL；所述克百威双功能基因工程抗体工作液体积为7mL，底物液体积为7mL，底物缓冲液体积为7mL，终止液体积为7mL，浓缩洗涤液体积为50mL。

7、一种权利要求4所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备克百威双功能基因工程抗体；

(2)制备包被克百威抗原的酶标板；

(3)按要求配制所需溶液并分装；

(4)组装试剂盒。

8、根据权利要求7所述试剂盒的制备方法，其特征在于步骤(1)所述制备克百威双功能基因工程抗体包括以下步骤：

(a)提取克百威单克隆细胞或经克百威免疫原免疫后的小鼠脾细胞的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链与连接肽的扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻重链基因并将其连接起来，将其插入适当的表达质粒，在大肠杆菌中表达，利用免疫亲和方法进行纯化，纯度由SDS-PAGE电泳鉴定；

(b)以重组噬菌体阳性克隆质粒为模板，PCR扩增抗克百威基因工程抗体片段；经酶切，纯化，亚克隆到携带辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP基因的载体pPhoA(+)，转化大肠杆菌，抗性筛选，获得重组大肠杆菌阳性克隆；诱导双功能基因抗体的表达得到克百威双功能基因工程抗体。