[发明专利]基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

目前对结核分歧杆菌有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T4789.7-2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法[食品安全检测与现代生物技术，化学工业出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。

以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测结核分歧杆菌的基因快速诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒，该试剂盒是基于环介导等温扩增技术来检测结核分歧杆菌的。

本发明的另一个目的是提供上述结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒的检测方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一、本发明的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、Bst DNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，其中：

所述两对引物为：

外引物F3：GGCTGGTCTCTGGCGTT，如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3：GGCCTATACAAGACCGAGCT，如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP：GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGTAGGCAGCCT，如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP：GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGGCAAGCCCT，如SEQ ID NO：4所示；

上述反应液每1L中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-Cl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol。优选的比例是：每1L中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mol。

上述裂解液1每1L中含有10～20mmol pH8.3的Tris-HCl、50～100mmol KCl、2.5～5mmol MgCl₂、5～10ml Triton X-100、5～10ml吐温-20和0.1～0.2g明胶。

上述裂解液2为蛋白酶K。

上述阳性对照为结核分歧杆菌基因组DNA。

上述显色液优选为SYBR Green I或EvaGreen。

上述稳定液优选为石蜡油。

二、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；