[发明专利]基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

权利要求书

1、一种结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于由两对引物、Bst DNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，

上述两对引物为：

外引物F3：GGCTGGTCTCTGGCGTT；

外引物B3：GGCCTATACAAGACCGAGCT；

内引物FIP：GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGTAGGCAGCCT；

内引物BIP：GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGGCAAGCCCT；

每1L反应液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-Cl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；

每1L裂解液1中含有10～20 mmol pH8.3的Tris-HCl、50～100 mmol KCl、2.5～5 mmol MgCl₂、5～10ml Triton X-100、5～10ml吐温-20和0.1～0.2g明胶；

上述裂解液2为蛋白酶K；

上述阳性对照为结核分歧杆菌基因组DNA。

2、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述显色液为SYBRGreen I或EvaGreen。

3、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L反应液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mol。

4、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L裂解液1中含有10mmol pH8.3的Tris-HCl、50mmol KCl、2.5mmol MgCl₂、5ml Triton X-100、5ml吐温-20和0.1g明胶。

5、根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述稳定液为石蜡油。

6、利用权利要求1所述试剂盒检测结核歧杆菌的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)将待测痰样液化后于离心管中离心，去上清，收集沉淀；

(2)在裂解液1中加入裂解液2，吹打混匀后，加入上述沉淀中，水浴裂解反应，反应结束后离心，上清即为样品模板DNA；

(3)在反应管中加入反应液38～40体积％、Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积％、稳定液52～54.5体积％、样品模板DNA 4.5～9体积％，恒温反应；

(4)在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

7、根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(1)中的液化为加入质量百分数4％NaOH溶液或胰酶对痰样进行液化。

8、根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(2)中，水浴温度为55～60℃，裂解反应时间为60min～90min。

9、根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。