[发明专利]一种具有抗血小板性栓塞活性的蛋白质及生产方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及文昌鱼基因AmphiC1qDC及其编码的蛋白P_C1qDC，以及该蛋白在制备治疗 心血管性疾病的药物上的应用。

背景技术

血小板在止血、血栓形成、动脉粥样硬化过程中起着重要的作用。长期的临床实践证 实，抗血小板药具有抑制血小板的黏附、聚集和释放功能，从而防止血栓形成，可有效地 防止心血管疾病的发生，并能延长患者的生存期。近年来，随着人们对冠状动脉粥样硬化 性心脏病，特别是急性冠脉综合征和支架植入后血栓形成机制的深入理解，抗血小板药物 在上述领域的应用越来越广泛。而且人口老龄化正推动心脑血管市场的增长，一些新开发 药物为制药公司提供大量机会。在国内市场中，抗血小板凝集类药物已抢占溶栓类和抗凝 血类药物的市场份额，占据抗血栓药物市场首位。近年来，溶栓药物市场份额缩水较厉害， 抗凝血药物的市场份额也呈逐年减少趋势。但相关分析可以看出，抗血小板凝集类药物的 增长情况良好，近年来的增长率为30％～65％。

C1q家族为生物体内中含有C1q结构域(因为折叠成球状，也常称为global C1q domain，简称gC1q)的一大类分子。该家族的各个成员在gC1q区域有高度的保守性， 这类分子包括经典补体途径的核心亚成分C1q(complement component 1)、参与糖脂和能 量代谢的adiponectin、胶原蛋白VIII和X、某些和动物冬眠相关的蛋白以及EMILIN等等。 C1qTNF1即为C1qTNF相关蛋白1，也是C1q家族成员之一，它具有C1q家族的特征性 胶原区和C1q球状区，并在血管壁组织中高度表达。通过重组人的C1qTNF1蛋白发现： 它可以和纤维状胶原特异结合并阻断胶原蛋白诱导的血小板凝集，阻断机理在于它竞争了 vWF和胶原的结合位点。因而，从医学角度，通过灵长类动物模型研究发现，C1qTNF1 可以阻止血小板性血栓形成，在医学的血管损伤性疾病中有重要意义。

文昌鱼(Branchiostoma belcheri)，属于脊索动物门(Chordate)，头索动物亚门 (cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，是一种海洋源性的 潜在药物开发物种。我们从文昌鱼中克隆了一个与人的C1qTNF1基因直系同源的C1q家 族成员AmphiC1qDC，并对其蛋白P_C1qDC进行了制备及研究了功能，发现P_C1qDC能够阻 止血小板性血栓形成，是一种潜在的治疗血栓的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于文昌鱼的新的抗血小板栓塞药物AmphiC1qDC基因 及其编码的蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述基因的P_C1qDC蛋白在制备治疗感染性疾病的药物中的 应用。

本发明通过兼并引物扩增和RACE全长扩增的方法从文昌鱼中分离得到AmphiC1qDC 基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

上述本发明AmphiC1qDC基因所编码的蛋白(重组蛋白C1qDC，命名为P_C1qDC)，其 氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；去除信号肽的成熟蛋白等电点为6.93，分子量为 25.8 kDa。

该成熟蛋白通过表达载体pETTRX-AmphiC1qDC在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表 达。

所述表达载体pETTRX-AmphiC1qDC是建立以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入His 的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体，该系统使P_C1qDC在大肠杆菌中大量 表达。

本发明所选择的青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)采集于山东省沙子 口水域。

本发明通过兼并引物扩增从成体文昌鱼的cDNA一链中克隆得到了含有C1q结构域的 部分片段，并对这个片段进行了5′和3′RACE扩增，得到了含有C1q结构域基因序列的全 长克隆，命名为AmphiC1qDC(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码 251个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，含有16个氨基酸的信号肽。 去除信号肽的成熟蛋白等电点为6.93，分子量为25.8kDa。具有抑制血小板凝集的活性。