[发明专利]一种具有抗血小板性栓塞活性的蛋白质及生产方法和应用

权利要求书

1.从中国青岛文昌鱼中克隆得到的AmphiC1qDC基因，其DNA序列如序列表中<400>1 序列所示。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质P_C1qDC，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。

3.权利要求2所述的蛋白质P_C1qDC的成熟蛋白，其氨基酸序列如序列表400<3>所示。

4.权利要求3所述的蛋白P_C1qDC在大肠杆菌中以部分可溶的形式表达的方法，按照以下步 骤进行：

(1)重组表达载体pETTRX-AmphiC1qDC的构建；

(2)将pETTRX-AmphiC1qDC转化大肠杆菌E.coli Rosetta-gami^TM；

(3)对转化的大肠杆菌E.coli Rosetta-gami^TM进行培养；

(4)重组文昌鱼P_C1qDC融合蛋白的纯化。

5.根据权利要求4所述的蛋白P_C1qDC在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在 于：所述的重组表达载体pETTRX-AmphiC1qDC的构建包括以下步骤：

(a)依据权利要求1所述的AmphiC1qDC基因的两端序列合成一对引物，上游引物含Kpn I和3C蛋白酶Prescission Protease切割位点，下游引物含Not I切割位点； 上游引物(P1)：

5’-GG GGTACC CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC GTCAGCATCTATGGCCAGGG-3’ 保护碱基Kpn I    3C蛋白酶切割对应位点    AmphiC1qDC基因序列 下游引物(P2)：

5’-ATAAGAAT GCGGCCGC TCACATGTTATACGTGGGGAAAA-3’

保护碱基    Not I    AmphiC1qDC基因序列

(b)以含AmphiC1qDC基因的pGEM T easy vector质粒为模板，P1、P2为引物PCR扩 增；

(c)将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pETTRX上，得到重组表达载体 pETTRX-AmphiC1qDC。

6.根据权利要求4所述的蛋白P_C1qDC在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在于： 步骤(3)的培养条件为：挑取单菌落接种于含有50mg/L氨卞青霉素，15mg/L卡那霉素， 35mg/L氯霉素和12.5mg/L四环素的2×YT培养基中，37℃振摇培养过夜活化菌种，按照 1∶100的比例接种到含有相应抗生素的200ml 2×YT液体培养基，37℃放大培养至OD600 约为0.9时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18℃诱导培养36hr后离心收集菌体。

7.根据权利要求4所述的蛋白P_C1qDC在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在于： 步骤(4)重组文昌鱼P_C1qDC融合蛋白的纯化方法为：

将总菌体用Tris缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，pH 8.5)洗涤，再用适量的Tris缓 冲液(150mMNaCl，50mM Tris，pH 8.5)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni²⁺Chelating Sepharose亲和色谱层析纯化，收集重组蛋白的洗脱峰。

8.权利要求2所述的蛋白在制备治疗心血管性疾病的药物的应用。