[发明专利]一种氯霉素全抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于化学技术领域，具体涉及一种含有氯霉素的复合物，特别是涉及一种氯霉素全抗原的制备方法。

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)，是一种有效的广谱抗生素，曾广泛应用于临床，但由于其会引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病，现已在临床治疗上严格控制。

但氯霉素因其廉价和有效性，目前用于各种动物疾病的控制，对畜禽疾病的控制和治疗发挥了重要作用，但其残留在动物的肉、奶、蛋中，仍会导致人们通过食物链摄取氯霉素，威胁着人类的健康。近几年欧美等发达国家已相继禁止或严禁使用氯霉素，并对畜产品中CAP残留制定了限量标准。我国农业部农牧发【200124】号文件规定，在马肝、鸡肉等中氯霉素的残留限量为不得检出，对于用酶联免疫ELISA和高效液相色谱分析法HPLC检测时，要求其检测限量为1ng/g。

测定食品中氯霉素含量的高效液相色谱分析方法和气相色谱等仪器分析方法、微生物法、比色法的样品前处理及测定过程操作繁琐，费用高，不适于大量样品筛查和在基层推广使用。而酶联免疫吸附测定法ELISA具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低和样品前处理相对简单等优点，适于现场监控和大量样品筛查，也可以直接应用于生产实践。为了建立酶免疫分析方法，首先必须制备出效价高特异性强的抗体。氯霉素是小分子物质(分子量＜1000道尔顿)，本身不具有诱导产生抗体的能力，为此，必须设法先将小分子氯霉素与载体蛋白质偶联制备成全抗原，这是酶免疫分析的关键所在。

但是小分子与载体蛋白结合时，结合比并非越高越好，太低很难引起血液的抗氯霉素免疫反应，太高则影响载体蛋白的空间结构，使其难于被T细胞识别而引起免疫反应。实验证明，结合比一般在10～40之间即可以获得较高特异性的抗体，也可以提高其酶联免疫检测的灵敏度。因此选用合适的氯霉素全抗原合成方法很重要。

目前常用的氯霉素全抗原合成方法有：重氮化法、混合酸酐法、戊二醛法、DCC法、EDC法等。重氮化法合成得到的抗原中间臂间隔太短而造成免疫原性不强；混合酸酐法操作繁复，控制条件严格，中间过程损失较大，且涉及到剧毒药品氯甲酸异丁酯；戊二醛法往往造成合成的载体蛋白之间偶联交联率较大；DCC法水溶性不强。现有技术中的EDC法，其结果不稳定，常出现合成不成功的情况。中国专利申请号200610155565.2的专利申请公开了一种氯霉素人工抗原的制备方法，是将氯霉素溶于无水吡啶中，并加入琥珀酸酐，使氯霉素分子导入了羧基，加交联剂EDC和6-氨基己酸，使氯霉素衍生物中的羧基与6-氨基己酸中的氨基缩合，增长了碳链，然后与载体蛋白质进行偶联，得到氯霉素—碳链—载体蛋白复合物。但所公开的制备方法耗时比较长，十几个小时甚至二十几个小时，过程也相对复杂。

目前缺乏一种高效、低成本、少副反应、简便的方法来合成氯霉素全抗原。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种氯霉素全抗原的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来予以实现的：

提供一种氯霉素全抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)将琥珀酰氯霉素溶于DMF中，加入不含氨基的缓冲溶液；

(2)往(1)中加入EDC和Sulfo-NHS，反应得到甲液；

(3)称取载体蛋白质，溶于PBS溶液，配制乙液；

(4)将甲液逐滴加入到乙液中，偶联反应后纯化得到氯霉素全抗原。

步骤(1)所述缓冲溶液的pH值为4.7～6.0。

步骤(1)所述琥珀酰氯霉素与DMF的比例为23mg琥珀酰氯霉素：0.4～0.6mLDMF；所述缓冲溶液加入量为每23mg琥珀酰氯霉素加入0.5mL缓冲溶液。

步骤(2)所述EDC和Sulfo-NHS的加入量为琥珀酰氯霉素∶EDC∶sulfo-NHS摩尔比为1∶0.8～2∶0.8～2，摩尔比优选为1∶1.2∶1.2；所述反应为室温反应2小时。

步骤(3)所述载体蛋白质为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清白蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH))等常用载体蛋白。

所述载体蛋白质为牛血清白蛋白；所述牛血清白蛋白与琥珀酰氯霉素的摩尔比为1∶35～175。

步骤(3)所述PBS溶液含有0.15M NaCl、浓度为0.05～0.1M、pH值为7.0～7.6，浓度优选为0.1M，pH值优选为7.4。

步骤(4)所述偶联反应为滴加完甲液后反应4小时。