[发明专利]定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医学临床检测领域，涉及一种快速检测常见染色体三体的方法，以及相应的试剂盒。

背景技术

流产和新生儿死亡最常见的原因是染色体异常，其中，第21、18、13号及性别染色体数目异常占出生后染色体异常总数的95％。唐氏综合征为最常见，新生儿的发病率为1/800～1/600，我国每年大约有26600个先天愚型痴呆儿出生，平均每20分钟就出生一例。由于目前尚无有效的治疗方法，患者智力低下、常伴有多种严重的先天缺陷，给家庭和社会造成沉重的负担。因此，及早检测并防止患儿的出生，对降低其发病率无疑具有非常重要的意义。

传统上采用羊水染色体检测方法，该方法存在以下缺陷：①对于妊娠胎儿的检查时间受到明显的限制(仅能检测妊娠16-22周的羊水染色体)；②对抽取样本的数量要求较多；③耗时长(15-20天的培养时间)；④工作量大(需要人工显微镜下对染色体区带进行分辨)；⑤不能保证母血污染羊水样本结果的准确性。而作为羊水染色体检查补充方法的脐带血及绒毛染色体检查的方法也同样存在以上缺点。

近年来，对染色体异常进行检测的分子遗传学方法很多，包括：荧光原位杂交技术(FISH)、引物原位标记技术(PRINS)、同源基因定量PCR(HGQ-PCR)和实时定量PCR(Real-time PCR)等。其中FISH和PRI NS在设备和技术上有较高要求，限制了这些方法的普及和应用；同源基因定量PCR(HGQ-PCR)技术，仅能对唐氏综合征进行检测；实时定量PCR方法，通过对21号染色体和其他染色体Ct值比率或差值的比较分析，来检测21号染色体的数目，但此方法对3个数量级以上的差别才能有较好的区分，而三体只是二体的1.5倍，区分度不大，另外Ct值的波动范围较大，轻微的变化都有可能对结果有影响，容易造成误诊，其检测的准确性还有待于进一步的研究和完善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、可靠的定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法。

本发明所述的一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，包括以下步骤：

A.样本的收集与处理：样本为外周血或孕妇产前样本，包括：孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的脐带血，或者孕13周前采集的绒毛，采用常规方法处理；

B.DNA提取：按常规苯酚-氯仿法提取前述样本的DNA，用紫外分光光度仪测OD₂₈₀及OD₂₆₀值以确定浓度和纯度，所需DNA纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀的值为1.6～1.8；

C.引物设计和合成：

选择分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的11个短串联重复序列位点即STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；

针对上述12个位点分别设计特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；用不同的荧光素对已合成的引物进行标记；

D.第一体系和第二体系的PCR扩增反应：

进行两个反应体系的PCR扩增反应，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412。

PCR扩增体系如下：

DNA模板               2～40ng

引  物                2～20pmol

热启动TaqDNA聚合酶    2U

10×PCR缓冲液         2.5μl

MgCl₂                 1.5mmol/L

dNTP                  200μmol/L

加水至总体积          25μl

PCR扩增条件为：95℃预变性11分钟，94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后在60℃下延伸60分钟；