[发明专利]定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法及试剂盒

权利要求书

1、一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.样本的收集与处理：样本为外周血或孕妇产前样本，包括：孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的脐带血，或者孕13周前采集的绒毛，采用常规方法处理；

B.DNA提取：按常规苯酚-氯仿法提取前述样本的DNA，用紫外分光光度仪测OD₂₈₀及OD₂₆₀值以确定浓度和纯度，所需DNA纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀的值为1.6～1.8；

C.引物设计和合成：

选择分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的11个短串联重复序列位点即STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；

针对上述12个位点分别设计特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；用不同的荧光素对已合成的引物进行标记；

D.第一体系和第二体系的PCR扩增反应：

进行两个反应体系的PCR扩增反应，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412。

PCR扩增体系如下：

DNA模板              2～40ng

引物                 2～20pmol

热启动TaqDNA聚合酶   2U

10×PCR缓冲液        2.5μl

MgCl₂                1.5mmol/L

dNTP                 200μmol/L

加水至总体积         25μl

PCR扩增条件为：95℃预变性11分钟，94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后在60℃下延伸60分钟；

E.PCR产物的检测：将PCR产物按现有遗传分析仪的操作说明进行处理，根据扩增产物片段大小及荧光素的不同进行区分，通过样本DNA扩增产物的STR形式的定量分析，参照业内制订的分子遗传学检测标准，判断被检者的染色体的数目是正常的二体，还是异常的三体，或是暂不能判定其染色体数目的情况；

F.第三体系的PCR扩增反应：

对于步骤E中未能达到上述检测标准的样本，再进行第三体系的PCR扩增反应，第三体系包括以下位点的引物：D18S51、D18S386和D13S317；PCR扩增体系和PCR扩增条件均与步骤D相同；

G.PCR产物的检测：与步骤E相同。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，外周血样本的收集与处理为：抽取1ml静脉血，加枸橼酸钠抗凝后用于步骤B。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，羊水样本的收集与处理为：抽取的羊水在4000rpm离心10min，弃上清液，用生理盐水洗涤沉淀一次，4000rpm离心10min，弃上清液，收集底部的细胞用于步骤B。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，脐带血样本的收集与处理为：抽取1ml脐带血，加枸橼酸钠抗凝后用于步骤B。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，绒毛样本的收集与处理为：选出具有明显分支结构的绒毛组织，用生理盐水洗涤二次，用于步骤B。

6、一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的试剂盒，其特征在于：包括三种不同的反应体系，每个反应体系均含有以下试剂：

10×PCR缓冲液，含15mmol/L MgCl₂，反应体系中稀释为1×PCR缓冲液；

dNTP，浓度为10mmol/L，反应体系中稀释为200μmol/L；

热启动TaqDNA聚合酶，浓度为5U/μl，反应体系中用量为2U；

引物，浓度为0.5～5μmol/L，反应体系中用量为2～20pmol；

其中，所述引物为针对12个位点分别设计的特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；其中11个位点是分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；

将所述引物分为三组，分别构成三个反应体系，其中，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412；第三体系包括以下位点的引物：D18S51、D18S386和D13S317。