[发明专利]孔雀石绿残留的酶联免疫检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种动物源性食品中孔雀石绿残留的酶联免疫检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用，其在养殖业中的使用未得到美国食品与药物管理局(FDA)的认可；根据欧盟法案2002/675/EC规定，动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制为2μg/kg；日本的肯定列表也明确规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留；我国在农业行业标准《NY5071-2002无公害食品鱼药使用准则》中也将孔雀石绿列为禁用药物。

2005年，福建、江西、安徽等省出口欧盟、日本、韩国的鳗鱼产品先后被检出孔雀石绿残留，我国水产品出口因此受严重影响；2006年，上海市场上的多宝鱼和香港市场上的桂花鱼，也都检出孔雀石绿残留。水产品中孔雀石绿的残留问题日益成为社会关注的焦点。

孔雀石绿在水生动物体内会很快代谢成无色孔雀石绿，无色孔雀石绿的毒性甚至超过孔雀石绿。因此，有关法规对动物源性食品中孔雀石绿残留限量的规定都是以孔雀石绿和无色孔雀石绿的总量为限量指标，要求相关的检测方法能检测出孔雀石绿和无色孔雀石绿总量。目前，孔雀石绿的检测方法以理化检测法和免疫学检测法为主。

通常，检测孔雀石绿的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱法(GC-MS)、理化检测法和免疫分析技术(IA)等等。HPLC法与GC-MS法是孔雀石绿残留检测的确证方法，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用。理化检测法多以有机溶剂萃取后过层析柱，然后观察颜色进行孔雀石绿残留的判断，此方法主观性强，对微量残留进行很难测定，而且无法定量，因此很难符合检测单位实际使用的要求。而酶联免疫分析(ELISA)快速检测技术因灵敏度高、特异性好、既可定性又可定量，且成本低、操作简单快速、一次检测样本量大、仪器化程度低现已成为常用的筛选方法。

检索相关文献与专利发现，国内关于孔雀石绿免疫检测的方法与试剂盒很少，检索到一篇中国专利《水产品中孔雀石绿间接竞争ELISA检测试剂盒》(申请号200510060995.1)中提到一种孔雀石绿酶联免疫试剂盒，此试剂盒采用的检测原理为，酶标板中包被有孔雀石绿抗原，样品与包被抗原竞争结合孔雀石绿抗体，洗涤去除未反应试剂，然后再加入酶标记抗抗体反应，再洗涤，加入底物显色，终止后，读数；该试剂盒由于采用间接竞争ELISA检测模式，操作复杂、步骤多，检测时间长，生产与保存成本高，很难满足实际应用的需求。

总之，现有酶联免疫试剂盒采用的检测方法复杂、繁琐，很难应用于实践，且现有技术由于普遍存在稳定性差、样品前处理及检测步骤复杂、设备条件要求较高、价格昂贵等不足，严重影响了孔雀石绿残留检测与监控，因此研制稳定性高、操作简单、设备要求低、廉价的孔雀石绿ELISA试剂盒具有非常重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有孔雀石绿检测产品中存在的不足，提供一种高特异性、高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量快速检测孔雀石绿的酶联免疫试剂盒。

本发明的另一目的是提供利用上述酶联免疫试剂盒检测孔雀石绿残留的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下测定原理：首先将孔雀石绿抗原包被于固相载体，例如酶标板上，然后加入标样或待测样品，再加入酶标记孔雀石绿抗体，包被抗原与待测样品中的孔雀石绿竞争酶标抗体，待测样品孔雀石绿含量高时，则与固相抗原结合的酶标抗体就少，反之结合在固相抗原上的酶标抗体就多，反应后加入底物进行显色加以测定，当酶标抗体量一定时，加入的待测样品含孔雀石绿越多，与固相抗原结合酶标抗体就越少，发色反应减弱，百分吸光度值低，反之，则发色反应增强，百分吸光度增高，因而根据百分吸光度值与孔雀石绿浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，再根据孔雀石绿的标准曲线和待检样品的百分吸光度值，即可推算出待测样品中孔雀石绿的浓度。

本发明的具体技术方案为：

提供一种孔雀石绿残留的酶联免疫检测试剂盒，包含下列成分：

(1)包被了孔雀石绿抗原的酶标板；

(2)酶标记孔雀石绿抗体工作液；

(3)孔雀石绿标准溶液；

(4)底物液；

(5)底物缓冲液；

(6)反应终止液；

(7)浓缩洗涤液；

(8)样品稀释液。