[发明专利]玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性AFP的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种测定肝癌特异性AFP的方法。

背景技术：

肝癌(HCC)是世界上最常见恶性肿瘤之一。以东南亚、西太平 洋地区及非洲东南部发病率最高。也是我国常见的恶性肿瘤。就死亡 率而言，为第三位癌症。肝癌的发病率呈一定的地区分布，沿海高于 内地，东南和东北高于西北、华北和西南部。肝癌多见于男性，男女 之比为2-5∶1，年龄大多数为40-49岁，越是肝癌高发区，这种性 别差别越明显，发病年龄也越轻。由于肝癌在确诊时已多属中、晚期， 缺乏有效治疗，几乎所有病例都有肝硬化的基础，因此，预后恶劣。 虽然近年来HCC非手术疗法有了很大进展，但手术切除仍然是目前最 有效的治疗方法。晚期HCC切除后复发率高，易转移，所以早期诊断、 早期治疗显得尤为重要。

AFP(甲胎蛋白)是由590个氨基酸组成的一种单链糖蛋白，分子 量为70KD，属于胚胎性蛋白，主要由胚胎时期的肝细胞和卵黄囊产 生，胃肠道粘膜上皮也可产生少量，出生后浓度即迅速下降，数月至 一年内接近成人水平＜20ng/ml，AFP诊断肝癌的价值很高，但早期 诊断肝癌有一定的局限性，鉴于一些非肝癌病人血清AFP也可以升 高，所以单独检测AFP来区别肝癌有一定困难。因为在部分良性肝病、 生殖系统和胃肠道的一些恶性肿瘤中AFP也可升高，而另一些肝癌患 者AFP始终持续低浓度阳性(20-200ng/ml)，针对上述问题，近年 来开展的甲胎蛋白亚组分肝癌特异性甲胎蛋白：hepatoma-specific α-fetoprotein(AFP)fraction(AFP-L3)及AFP-mRNA的研究大大 提高了AFP临床应用价值。不同来源的AFP其糖链的组成和结构上存 在着不均一性，含有岩藻糖苷化糖链的AFP异质体与LCA有较强的亲 和力称LCA结合型AFP，与肝癌关系较大。根据其与植物血凝素的亲 和性不同，采用电泳法分离出扁豆凝集素(LCA)结合AFP即AFP-L3。 AFP-L3百分率可用AFP-L3条带/总AFP条带×100％表示。正常值为 10％-15％，＞15％即表示HCC，即使总AFP仅轻微升高，或影像学上 没有得到证实，都提示在不久的将来即为HCC。因此，AFP-L3％可用 于肝癌早期的辅助诊断。

诸多报道表明AFP异质体可明显提高HCC实验室诊断的特异性、 灵敏度及早期诊断阳性率。迄今为止的异质体测定方法对于技术的要 求较高、操作繁琐、试剂昂贵、时间长、结果的判断需要特殊设备等， 大大限制了AFP异质体测定在临床上的普遍应用。因此，建立一种快 速方便、特异、敏感、无需特殊仪器的适合于基层医院和肝癌高危人 群普查使用的AFP-L3检测方法就显得非常必要和迫切。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种方法简单、易操作的玻璃微柱亲和层 析测定肝癌特异性AFP的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性AFP的方法，其特征是： 依次包括下列步骤：

(1)制亲和层析柱装置，玻璃微柱0.7cm×15cm；

(2)使用洗脱液清洗柱子的每个角落除去气泡，关闭柱子出 口并且留下1～2cm的缓冲液在柱子中，将LCA-Sepharose 4B(小扁 豆凝集素琼脂糖凝胶4B：lens culinaris agglutinin Sepharose 4B) 从4℃冰箱中取出平衡至室温，然后沿柱壁向层析柱中加入，用10倍 于柱体积的洗脱液平衡，关闭出口；

(3)取血清0.2ml加洗脱液0.8ml上层析柱，洗脱液洗脱，滴 速约8～12/min，每次收集1ml，共收集15管至A₂₈₀＜0.02，随后以解 吸液洗脱，方法同前，共收集10管，至A₂₈₀＜0.02，收集完毕用洗脱 液清洗并平衡层析柱，用同样的方式分离第二个标本，每个标本共收 集25管；

(4)收集25管液体进行A₂₈₀吸光值及AFP浓度测定，以标准品 浓度为横坐标，结合率为纵坐标制作标准曲线，根据样品的结合率在 标准曲线上查出样本的AFP浓度，解吸液收集的即为AFP-L3，AFP-L3/ 总AFP即为AFP-L3％；