[发明专利]透明质酸接枝聚乙烯亚胺共聚物、制备方法及其作为基因载体的应用

说明书

技术领域

本发明涉及高分子聚合物基因载体和基因治疗领域，具体涉及透明质酸接枝聚乙烯亚胺共聚物、制备方法及其应用。本发明还涉及共聚物和DNA质粒形成的复合物、制备方法及其应用。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是通过合适的载体将目的基因传递到患者特定组织细胞(靶细胞)内进行适当的表达，以纠正或改善该致病基因所产生的缺陷，达到治疗疾病的目的。近二十年来，基因治疗作为人类疾病治疗史上的一次革命，已成为国内外的研究热点。基因治疗的关键是基因传递的载体，它是将目的基因转运到患者体内靶细胞的工具，一般包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率高，但具有潜在的致癌性和自身免疫原性，还可能造成细胞病理改变，使其应用受到一定限制。非病毒载体作为病毒载体的重要补充，具有病毒载体无法比拟的优点，它细胞毒性低、外源基因整合概率低、无基因插入片段大小的限制、使用简单、制备方便、易于生产、便于保存和检验，因而受到人们的广泛关注。

非病毒载体主要分为阳离子聚合物和阳离子脂质体两大类。阳离子聚合物作为基因载体具有以下优点：(1)提供与DNA自组装的动力，有利于保护DNA免受降解；(2)压缩DNA成为比游离DNA体积小的复合物颗粒，有利于进入细胞；(3)使复合物颗粒之间产生静电排斥作用，稳定复合物；(4)与细胞膜产生静电吸引作用，促进复合物内吞。自1995年Boussif等报道了聚乙烯亚胺(PEI)可作为非病毒基因载体后，由于其具有制备方法简单、价格便宜、转染效率高和“质子海绵效应”等优点，成为阳离子聚合物作为基因载体研究最快的领域。

聚乙烯亚胺(polyethylenimines，PEI)的单体结构式为CH₂CH₂NH，PEI最早是用于污水处理工业上作为净化剂使用的，它以乙烯亚胺等作为单体合成树枝状或者直链的高聚物。常用于基因载体的PEI分子量为22KDa(直链型)和25KDa(支链型)。在PEI的聚合物的骨架中，每3个原子中便含1个可质子化的氮原子，有较强的压缩DNA的能力和细胞黏附能力，同时能保护DNA不被血液调理素等成分降解。PEI/DNA复合物被摄取进入细胞的内含体后，内含体不断酸化(pH值约为4.5-5.0)，PEI中的多数的氨基团可被质子化(25KDa的PEI表观pKa值为8.5)，这使得该复合物在内含体中有较大的质子缓冲能力发挥“质子海绵”作用，最终成功从内含体中逃逸，为提高治疗基因的转染效率提供了前提保障。

但是PEI与DNA所形成的复合物由于带有过剩的正电荷，与细胞表面的黏附没有特异性，而且大量的正电荷也可能给细胞带来急性及延迟的毒副作用。为了解决PEI等非病毒基因传输载体的靶向性以及安全性问题，很多人进行了大量的研究。譬如在PEI上连有针对特定细胞的靶向配体(如叶酸，转铁蛋白，半乳糖等等)，提高PEI/DNA复合物的靶向摄取能力，或者对PEI用一些亲水性物质进行修饰(如PEG)，降低PEI的正电荷分布，提高复合物的血浆稳定性和降低细胞毒性等等。

但是非常遗憾，尚没有一种高分子聚合物载体同时具有靶向性和亲水性，且细胞毒性较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术缺点，提供一种同时具有靶向性和亲水性的高分子聚合物及其制备方法。

本发明还提供上述聚合物的用途。

我们发现，广泛存在于机体多种组织的透明质酸(HualueonixAcid，HA)(式I)是一种内源性物质，它是以葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖为双糖单位组成的直链高分子多糖，平均分子量为5000～10⁷Da。HA分子中的每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下均可解离成负离子并可与金属离子成盐(比如说透明质酸钠)，具有水溶性。根据HA分子量以及浓度的不同，HA分子在生理条件下的水溶液中形成一定的线团网状结构，可以附着在细胞等物体的周围。而且许多细胞表面(比如上皮细胞，巨噬细胞，单核吞噬细胞等)存在HA的特异性受体(比如CD44和RHAMM)，通过HA与细胞表面的HA受体发生特异性结合，实现HA与细胞的特异性粘附，并调节细胞的移动以及吞饮过程。鉴于HA同时具备亲水性和一定的靶向性，利用其修饰聚乙烯亚胺，可以解决减少细胞毒性和提高靶向性的关键难题。

本发明提供如下技术方案。

一种阳离子接枝共聚物，由聚乙烯亚胺共价连接在主链透明质酸二糖单元中被氧化的2位和3位上共聚而成。所述聚乙烯亚胺还包括其衍生物，透明质酸也包括其衍生物。