[发明专利]一种草茎点霉的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及草茎点霉(Phoma herbarum)的电穿孔遗传转化技术，适用于草茎点霉的遗传工程以及草茎点霉分子生物学研究等领域。

背景技术

草茎点霉不仅是某些动植物的病原菌，而且也是一种可用于杂草防治的生防菌。由草茎点霉引起的动植物病害有植物黑胫病和鲑鳟鱼类的鳔真菌病(吴庆禹等，东北林业大学学报，2005，33(2)：43-45；Mohamed Faisal et al，2007，Mycopathologia(2007)163：41-48)。目前已从草茎点霉中分离出了至少三种不同类型的活性化合物(Jose′Fausto Rivero-Cruz et al，J.Nat.Prod.2003，66，511-514；Vikrant et al，J.of Phytopathol.154(7-8)：461-468；Xiao Bing Yang et al，Biochimie 87：747-754)。近年来，我们从草茎点霉中分离到了一种抗肿瘤的多糖YCP，生物活性和临床前的研究均表现出良好的结果。在国家863、国家自然科学基金等国家级科研项目基金的大力支持下，YCP多糖的研究已经非常接近成药了。在相关的基础研究方面，我们不仅建立了草茎点霉成熟的工业发酵工艺，而且对YCP多糖的生物合成途径也展开了深入的研究。因此，草茎点霉非常有望成为具有良好开发前景的丝状真菌之一。可以预见，今后很多研究将试图通过基因工程的办法改良菌种。同时，草茎点霉对植物和鱼类致病的分子生物学机制研究也将引起高度重视，但是，遗传转化方法的研究是对草茎点霉实施基因工程和分子生物学研究的前提。

丝状真菌的遗传转化目前主要有醋酸锂介导的孢子转化法、PEG介导的原生质体转化法、农杆菌介导的转化法和电穿孔转化法。在草茎点霉中，目前还没有建立任何转化方法。我们尝试过前3种转化方法，均不理想。电穿孔转化技术在微生物等的遗传转化中具有较高的效率，而且简单易行，在原核生物中已有广泛的应用。Bio Rad、Phamacia等世界著名公司已开发了电穿孔仪。

本发明首次利用了电穿孔技术对草茎点霉实施了外源基因转化，找到了合适的转化条件，并优化了裂解酶的组合，转化方法简单，转化效率高，此法可用于草茎点霉的遗传工程以及分子生物学研究和应用。

发明内容

本发明目的是提供一种利用电穿孔技术对草茎点霉进行外源基因的遗传转化方法，并找到转化效率较高的转化参数组合，可用于草茎点霉基因工程以及分子生物学研究等领域。

本发明达到发明目的所采用的技术方案是：利用真菌细胞壁降解酶对草茎点霉的细胞壁进行处理，得到原生质体并进行纯化，纯化的原生质体和适量外源基因(DNA)水溶液进行混合，然后利用电穿孔仪对混合液进行电击处理，电击处理的原生质体可以吸纳外源DNA，从而实现了外源DNA对草茎点霉的遗传转化。

本发明的技术方案如下：

一种草茎点霉的遗传转化方法，它由下列步骤组成：

(1)将草茎点霉原生质体用缓冲液EB悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度至10⁷-10⁸/ml，所述的缓冲液EB为一种水溶液，其中含：浓度为2mM的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸(HEPES)，pH7.5，浓度为0.6M的甘露醇(mannitol)，浓度为1mM的MgCl₂，在121℃高压灭菌20min，

(2)将用于转化的外源DNA溶于无菌去离子水至终浓度为1μ1g/μl，每100μl原生质体液中加入5μg DNA，混匀，冰浴冷却20min，成混合液，所述的外源DNA为任何可以转化真菌的DNA或质粒，

(3)在预冷的电击杯中加入步骤(2)所得混合液，冰浴冷却5min后用电穿孔仪进行电击，