[发明专利]一种草茎点霉的遗传转化方法

权利要求书

1.一种草茎点霉的遗传转化方法，其特征是它由下列步骤组成：

(1)将草茎点霉原生质体用缓冲液EB悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度至10⁷-10⁸/ml，所述的缓冲液EB为一种水溶液，其中含：浓度为2mM的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸，pH7.5，浓度为0.6M的甘露醇，浓度为1mM的MgCl₂，在121℃高压灭菌20min，

(2)将用于转化的外源DNA溶于无菌去离子水至终浓度为1μg/μl，每100μl原生质体液中加入5μg DNA，混匀，冰浴冷却20min，成混合液，所述的外源DNA为任何可以转化真菌的DNA或质粒，

(3)在预冷的电击杯中加入步骤(2)所得混合液，冰浴冷却5min后用电穿孔仪进行电击，

(4)电击后向电击杯中加入1ml添加甘露醇至终浓度为0.6M的甘露醇的CM液体培养基，冰浴冷却20min，悬浮后与5ml融化的0.7％ CM固体培养基混合，平铺于添加蔗糖至终浓度为0.2M的1.5％CM固体培养基平板上，28℃培养12h后，覆盖10ml融化的0.7％CM固体培养基，其中添加潮霉素至终浓度为250μg/ml的潮霉素，在28℃培养至转化子出现，所述的CM液体培养基的配方为：3％蔗糖，0.3％硝酸钠，1％磷酸钾，pH5.8，0.05％ KCl，0.05％ MgSO4，0.001％ FeSO4，0.2％酵母提取物，121℃高压灭菌20min；所述的0.7％CM固体培养基的配方为：CM液体培养基中加入终浓度为0.7％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min；所述的1.5％CM固体培养基的配方为：CM液体培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min，

(5)将转化子在添加终浓度为125μg/ml的由外源DNA所编码的抗生素的1.5％CM固体培养基平板上继代培养，稳定生长后保存，所述的外源DNA编码的抗生素优选潮霉素。

2.根据权利要求1所述的草茎点霉的遗传转化方法，其特征是：所述的外源DNA为带有潮霉素抗性基因的质粒。

3.根据权利要求1所述的草茎点霉的遗传转化方法，其特征是：所述的草茎点霉的原生质体的制备方法如下：

(1)用缓冲液LS配制终浓度均为1mg/ml的由蜗牛酶、纤维素酶和裂解霉组成的细胞壁降解酶液，所述的酶液经过滤灭菌后每20ml酶液加入约0.9-1.1g湿菌体，置30℃的摇床，转速为50-100rpm，酶解3-4h，得原生质体酶解液。所述的缓冲液LS的配方为：20mM磷酸钾，pH5.8，0.6M甘露醇，121℃高温灭菌20min，

(2)原生质体酶解液过滤除去菌丝残片，离心，得到原生质体沉淀。