[发明专利]发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵法生产乳酸的菌株及其发酵生产技术，尤其是一种能够高效率的高选择性的生产高光学纯度与高化学纯度的D-乳酸菌株及其相应的制造技术，所属菌株在生产D-乳酸时不产生杂质琥珀酸和富马酸等；另外，本发明还涉及这种D-乳酸高产菌的发酵与代谢控制方法，属于微生物发酵工程技术领域。

背景技术

乳酸，是世界上公认的三大有机酸之一，根据光学纯度可以将乳酸分为L-乳酸、D-乳酸和DL-混合乳酸，由于D-乳酸及DL-混合乳酸因其影响细胞的正常生理代谢，1998年被世界卫生组织禁止药用和食用，L-乳酸及其衍生物主要用作食品添加剂、防腐剂、还原剂等用于食品、啤酒、白酒、医药、化工、石油和皮革加工等行业。

近年来随着对乳酸应用研究的深入，特别是由乳酸聚合获得生物可降解材料——聚乳酸的深入研究，D-乳酸的应用前景和应用需求也越来越广泛。如：1、通过向L-乳酸中添加一定量的D-乳酸，调节用于聚合的D-乳酸的含量而控制聚乳酸的物理特性，使聚乳酸逐步取代各种非降解的石化来源的塑料；2、可以用于研究乳酸抑制和作为酶法分析乳酸的标准品，作为一些反应的试剂盒等；3、纯的D-乳酸作为一个手性中心，是合成多种手性物质的前提，在医药、农药制药和除草剂方面的实际应用正日益引起人们的重视。如钙拮抗剂降压药，皮考啉酸衍生物以及优良除草剂——骠马、威霸、二甲四氯丙酸、氟系等的重要合成前体；4、D-乳酸的一些衍生物也有较广泛的应用，以D-乳酸为原料的乳酸脂类广泛用于香料、合成树脂涂料、胶黏剂印刷油墨等生产中，而且可用石油管道清洗、电子工业清洗及S-2-氯丙酸除草剂Duplosan R的手性合成原料，等。

随着研究的深入，D-乳酸用途不断扩宽，市场需求量也将随之不断增加，但是D-乳酸的工业化生产几乎没有，究其原因，主要是由于缺乏高效的D-乳酸生产技术。

不少微生物可以代谢葡萄糖形成D-乳酸或DL型混合乳酸，同时会形成乳酸以外的副产物例如醋酸、乙醇、丙酮酸等低分子量有机化合物。这些有机酸在纯化过程中很难完全出去，导致最终产物乳酸的品质下降并严重影响其后续运用。另外，由于光学异构体的混入导致光学纯度下降也变成严重的问题。

为了提高D-乳酸的化学纯度，我们需要降低乳酸发酵时副产物特别是有机酸的含量。近年来基因重组技术飞速发展，可以敲出微生物的特定基因，从而可能特异性的阻碍副产物的合成。但是该方法并不适合多种微生物，所以在乳酸菌或丝状真菌等原来能高效生产乳酸的微生物中并不适用。其原因是上述微生物基因组信息不充分，而且作为基因重组的宿主也不能广泛适用。

但是，大肠杆菌的基因组信息丰富，而且常被作为基因重组宿主。特别是从增殖迅速或培养容易等方面考虑，最优选大肠杆菌。由于大肠杆菌只能合成D-乳酸，所以在得到光学纯度高的D-乳酸时，也是最合适的宿主。但是，野生型大肠杆菌的D-乳酸生产效率很低，而且在发酵工程中伴生的低分子量有机酸等副产物含量很高，即不能高效地代谢底物(如葡萄糖)为单一D-乳酸产品。

为了解决这些问题，采用基因重组方法，改变菌株的代谢途径，选择性地高效生产D-乳酸。如，通过基因突变及基因表达，实现大肠杆菌合成同质乳酸，乳酸的合成效率提高到6％；另一个例子是将大肠杆菌代谢葡萄糖过程中的丙酮酸脱氢酶编码基因敲除，然后用乙酸进行菌体生长，再用葡萄糖流加进行乳酸的合成，乳酸的合成效率提高到8％。前一个例子说明了大肠杆菌乳酸合成途径在基因水平上的可操作性；后一个例子则说明，在利用大肠杆菌合成乳酸时，于乳酸合成阶段关闭乳酸前体物质丙酮酸经三羧酸循环被完全代谢掉的代谢途径，对乳酸的合成是有意义的；但乙酸显然不能作为工业化乳酸生产时的原料。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，能够合成高光学纯度、少有机酸副产物、高选择性的D-乳酸，且发酵工艺简洁易控。

本发明的技术方案是：发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，利用D-乳酸高产重组菌，在20～45℃条件下分阶段发酵30～50h，产D-乳酸水平达到12％，D-乳酸的光学纯度达到99.5％以上。

进一步地，上述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其中，所述D-乳酸高产重组菌，先在20～30℃下利用葡萄糖快速生长，形成菌体而但不形成D-乳酸，然后在37～45℃下菌体停止生产，但利用葡萄糖快速合成D-乳酸且不形成其它有机酸。